酸奶中常见真菌的分离、鉴定与快速检测

杜 莹,潘佩平,李 敏,李 瑶,范晓军*

(1.山西省生物研究所,山西 太原 030006；2.太原理工大学 化学化工学院,山西 太原 030024)

乳制品是一种营养丰富,容易被人体消化吸收的天然食品,随着人们生活水平的提高,相关产品已经成为生活中常见的健康食品。但是营养丰富的乳制品也是各种微生物青睐的温床,这导致乳制品的保质期非常有限,比如经巴氏杀菌的乳制品保质期一般不超过7 d(巴氏鲜奶占全球液态奶70%的市场份额)［1］,近些年市场占有量越来越大的发酵酸奶,其保质期最多也只有21 d［2］。

另一方面,国家《食品安全法》和《企业生产乳制品许可条件审查细则(2010版)》中明确要求企业必须对所生产、加工的乳制品进行出厂前微生物检验,包括5种指示菌和5种致病菌的检测［3］。目前乳制品企业基本都是采用传统的平板培养法来检测微生物,这种方法的检测周期一般在3～5 d左右,甚至有些致病菌不能仅凭菌落形态来判定,需要配合其他生化反应试验做进一步鉴定,这无疑又增加了检测周期。作为一种快速、准确的检测方法,荧光定量聚合酶链式反应(realtime-fluorescence quantitative-polymerase chain reaction,RT-FQ-PCR)技术已经被权威部门认可并纳入部分食品微生物检测国标中［4］,尤其是近些年越来越多的国家标准中采纳了这一方法。如进出口行业对难于培养的霍乱弧菌、副溶血性弧菌等微生物的检测都是采用荧光定量PCR技术［5-6］。

荧光定量PCR因其准确、快速等特点,已用于乳品中微生物快速检测。张巧艳等［7］将这一技术应用于乳制品中沙门氏菌的检测,将沙门氏菌的检测时间缩短至3 h,但该方法在3 h的检测下限为100 CFU/mL,在微生物含量较低的情况下该方法仍然存在一定的假阴性。在酵母的快速检测上,夏乾峰等［8］建立了一种可以检测5种酵母菌的荧光定量PCR方法,其优化后的荧光定量PCR检测方法的灵敏度为5CFU/mL,然而该方法的检测对象为纯化后的酵母菌,未深入研究样本类型对检测灵敏度的影响。显然,酸奶作为一种高蛋白含量的样本类型,在DNA提取过程中存在高浓度蛋白背景污染的问题,此外,真菌具有较为致密复杂的细胞壁结构,这些因素都会影响对酵母、霉菌DNA检测的准确性。目前,使用荧光定量PCR技术检测乳制品中真菌的研究还鲜有报道。本研究首先对导致酸奶腐败变质的微生物进行分离、鉴定,通过改良的DNA提取方法,获取酸乳中微生物总DNA,建立了污染微生物的荧光定量PCR标准检测曲线,形成了一套乳制品常见微生物的快速检测体系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

成品酸奶：市售某品牌酸奶；SYBR Green-qPCR扩增试剂：北京天根生化科技有限公司。

孟加拉红固体培养基：称取蛋白胨5.0 g,葡萄糖10.0 g,磷酸二氢钾1.0 g,无水硫酸镁0.5 g,琼脂20.0 g,孟加拉红0.033g,加入蒸馏水中,加热融化,补足蒸馏水至1 000 mL,分装后121℃灭菌20 min。倾注平板前,用少量乙醇溶解0.1 g氯霉素加入培养基中。

1.2 仪器与设备

YXQ-LS-30S2型立式压力蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司；Mastercycler pro SPCR仪：艾本德中国有限公司；WD-9413C型凝胶成像分析仪：北京市六一仪器厂；DH-360电热恒温培养箱：北京中兴伟业仪器有限公司；CFX96Touch荧光定量PCR仪：美国伯乐生命医学产品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种分离

取10 mL经过巴氏灭菌的新鲜制备的酸奶,开盖置于空气中,室温放置7 d。待空气中的微生物已经自然沉降至酸奶上并形成肉眼可见的菌落后,挑取酸奶上出现的不同形态的菌落至5 mL灭菌蒸馏水中,振荡混匀后取1 mL涂布至孟加拉红固体培养基上。28℃条件下恒温培养5 d。固体培养基上长出菌落后挑取至孟加拉红液态培养基中扩培。

1.3.2 菌种鉴定

取1 mL经过步骤1.3.1制备的菌液,离心后将沉淀物置于-80℃中冷冻30 min,随后采用十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium ammonium bromide,CTAB)法抽提沉淀菌体的DNA。用真菌ITS扩增通用引物ITS5(5‘-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3‘)和ITS4(5‘-TCCQCCGCQTATTGATATGC-3‘)对提取的DNA进行扩增［9］,扩增产物经纯化后进行Sanger上机测序。将测序结果在NCBI数据库中Blast同源比对检索,查找与被测菌种在ITS序列相似性最高的物种。

1.3.3 DNA条形码确定

在进行物种DNA鉴定时,首先选择最佳的DNA扩增片段,不同的DNA序列存在不同的扩增效率和区分层次［10］。针对1.3.1分离鉴定出来的微生物,为了选择一个合适的基因片段作为荧光定量PCR检测靶点,本研究选取了4个较为常用的基因片段进行扩增效率比较,分别为β-tubulin［11］、RPB1［12］、LSU［13］、ITS,针对四个片段设计的PCR引物及序列见表1。

表1 PCR引物序列设计Table 1 Sequences design of PCR primers

1.3.4 荧光定量PCR检测体系

将扩培的真菌原液进行梯度稀释,分别稀释10、102、103、104倍,取104倍稀释的菌液100 μL涂布于孟加拉红固体培养基上,28℃条件下培养至形成了明显菌落并且菌落未连在一起的时候,对菌落进行计数。

将上述梯度稀释后的菌液各取100μL,加入到500μL灭菌酸奶样品中,充分混匀后12 000 r/min离心5 min,去上清液,将沉淀物放入-80℃冰箱中冷冻30 min后进行液氮研磨,用1.3.2中描述的方法抽提各稀释浓度梯度下的微生物DNA。用1.3.3实验步骤确定的最佳扩增基因片段,对各浓度梯度下提取的DNA进行SYBRGreen-qPCR扩增,记录每个反应的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数Cq值及对应的荧光检测值。建立检测菌数与Cq值的关联曲线。结合DNA提取的洗脱液体积70μL及PCR时可用最大模板量18μL,指出检测菌数X的计算公式为N×18/70×r,其中N为平板计数结果,r为稀释倍数［14-15］。

SYBRGreen-qPCR的反应体系(20μL)：EvaGreen 2×qPCRMasterMix10μL,正向引物10μmol/L 1μL,反向引物10μmol/L 1μL,基因组模板18μL。SYBRGreen-qPCR反应条件为：95℃、3 min,进入36个循环(95℃、15 s,56℃、30s,72℃、30 s),在72℃延伸阶段进行荧光采集,最后72℃恒温5 min。

2 结果与分析

2.1 微生物分离与鉴定结果

酸奶置于空气中静置7 d后,发现9个肉眼可见的菌落,将其转移至孟加拉红培养基纯化、扩培,经ITS序列鉴定这9个菌落分别属于红酵母(Rhodotorula sp.)、青霉菌(Penicillium sp.)、根霉菌(Rhizopus sp.)这三种菌种(菌落形态参见图1),其中红酵母出现的概率最大,具体真菌鉴定结果参见表2。

图1 三种纯化真菌平板菌落形态Fig.1 Colonial morphology of three purified fungiplates

表2 酸奶污染真菌基于ITS序列鉴定结果Table 2 Identification results of fungiin yogurt based on ITS sequence

由此可见,酸奶常见的真菌污染类型以酵母和霉菌为主,其中酵母出现概率更大,在酸奶的实际的加工生产环境中,要重点预防空气中红酵母(Rhodotorula sp.)和根霉菌(Rhizopus sp.)的污染。

2.2 检测DNA条形码的确定

图2 酵母菌N1及根霉菌X1 4种PCR产物凝胶电泳图Fig.2 Gel electrophoresis of four PCR products from yeast N1 and Rhizopus sp.X1

分别提取表2中的编号为N1酵母菌和编号为X1根霉菌基因组,作为PCR扩增模板,用表1中设计的PCR引物分别进行PCR扩增及电泳检测,以选取最佳的DNA检测片段。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测,检测结果如图2。由图2结果可知,ITS和LSU这两个基因片段在酵母和霉菌均呈现较好的扩增效果,而另两种基因片段扩增失败,因此将ITS和LSU作为快速检测酸奶中真菌的DNA条形码。

2.3 荧光定量PCR快速检测体系

在完成各菌液浓度梯度的技术和计算后,将其回接至酸奶中,按照上述方法提取真菌基因组DNA,利用ITS片段作为检测靶点,进行荧光定量PCR检测并收集相关数据,各浓度梯度的真菌均得到了完整的扩增曲线,具体检测菌数与Cq值参见表3。

表3 不同浓度的真菌检测数量与Cq值Table 3 Determination results of different fungiconcentration and Cq value

将表3两种真菌的被检数量对数值lgX(x)与检测采集的Cq值(y)进行关联分析,并得出两者之间的拟合关联方程式,具体关联结果分别参见图3。

图3 红酵母(A)与根霉菌(B)检测数量与Cq值关联曲线Fig.3 Correlation curve between count and Cq value of Rhodotorula sp.(A)and Rhizopus sp.(B)

通过图3的趋势线可知,随着真菌数量的增加,检测系统的荧光值也在随之升高,这说明荧光强度与真菌数量存在很强的关联性,通过绘制与荧光值相对等的Cq值和真菌数量的对数值之间的关联曲线,在红酵母50 CFU/mL到50×104CFU/mL的5个数量级之间获得相关系数为0.9362的良好线性关系曲线(图3a),回归方程为Y=0.536X+34.462(Y代表系统检测到的Cq值,X代表红酵母数量的对数值)。在根霉菌2 850 CFU/mL到2 850×104CFU/mL的5个数量级之间获得相关系数为0.9581的良好线性关系曲线(图3b),回归方程为Y=1.374X+29.722(Y代表系统检测到的Cq值,X代表根霉菌数量的对数值)。10次重复检测500CFU/mL红酵母获得的相对标准偏差为3.7%,10次重复检测28 500 CFU/mL根霉菌获得的相对标准偏差为3.2%,说明此体系对该类型真菌的检测重复性较好。综上所述,本研究所构建的荧光定量检测体系,可在5 h完成酸奶样品中真菌核酸的荧光定量检测,获得检测Cq值后根据各自的关联方程可推算出样品中的真菌数量。

3 结论

本研究首先明确了空气中能造成酸奶污染的真菌种类,红酵母(Rhodotorula sp.)、青霉菌(Penicillium sp.)、根霉菌(Rhizopus sp.)是三种能在酸奶中生长的真菌种类,其中红酵母最为常见,在实际的酸奶加工生产中应该重点预防。本研究的真菌分离鉴定结果对乳制品加工企业在真菌污染防治上提供了针对性参考。

在酸奶污染真菌的DNA快速检测技术流程上,本研究首先解决了真菌破壁困难、乳品高蛋白背景的基因组抽提问题,并进一步比较了不同基因片段的PCR扩增效率,明确了适合酸奶污染真菌的最佳检测DNA条形码和条件,在此基础上建立了初始检测真菌数量与荧光信号值之间的关联,形成了一套酸奶真菌DNA快速检测体系。相比传统培养检测方法,本研究所形成的快速检测体系,检测流程缩短了检测时间至5 h内,加快了酸奶的出厂时间,从而也延长了酸奶的货架期。

参考文献：

［1］张素霞.中国奶类的消费和发展分析［J］.中国酿造,2008,27(24)：128-129.

［2］陈麟璋,张亚平.酸奶保质期探讨［J］.乳品加工,2006(10)：59-60.

［3］唐 玲,胡 萍,周国君.乳品中腐败微生物检测及污染途径的研究进展［J］.中国酿造,2012,31(4)：1-5.

［4］朱军伟,杭 锋,王钦博.实时荧光定量PCR技术在乳品微生物学中的应用研究进展［J］.安徽农业科学,2014,42(15)：4764-4766.

［5］张世英,洪帮兴,司徒潮满.荧光定量PCR技术在霍乱弧菌检测中的应用［J］.中国公共卫生,2003(3)：345-347.

［6］俞春松.荧光定量PCR技术快速检测食物中副溶血性弧菌［J］.中国高等医学教育,2010(5)：144-148.

［7］张巧艳,陈亭亭,陈笑芸.基于SYBRGreen I荧光定量PCR建立生乳及乳制品沙门氏菌快速检测技术［J］.浙江农业学报,2012,24(5)：914-921.

［8］夏乾峰,傅琼瑶,乌日强.荧光定量PCR定量检测5种假丝酵母菌方法的建立［J］.检验医学,2015,30(3)：265-268.

［9］CONRAD L,KEITH A,SABINE H,et al.Nuclear ribosomal internal transcribed spacer(ITS)region as a universal DNA barcode marker for Fungi［J］.Proc Natl Acad Sci,2012,109(16)：6241-6246.

［10］LOONEN A J,DEJAGERCP,TOSSERAMSJ,et al.Biomarkers and molecular analysis to improve blood stream infection diagnostic in an emergency careunit［J］.PLoSOne,2014,9(1)：e87315.

［11］HUANGCH,CHANGM T,HUANGL,et al.Species identification of Wickerhamomyces anomalus and related taxa using β-tubulin(β-tub)DNA barcodemarker［J］.Yeast,2012,29(12)：531-535.

［12］DONNELL K O,WARD T J,ROBERT V A RG,et al.DNA sequencebased identification of Fusarium：Current status and future directions［J］.Phytoparasitica,2015,43(5)：583-595.

［13］STOCKINGERH,KRÜGERM,SCHÜSSLERA,et al.DNA barcoding of arbuscular mycorrhizal fungi［J］.New Phytol,2010,187(2)：461-474.

［14］XIAQF,XUSX,WANCDS,etal.Developmentof anovel quantitative real-timeassay using duplex scorpion primer for detection of Chlamydia trachomatis［J］.Exp Mol Pathol,2007,83(1)：119-124.

［15］XIA QF,LIUJB,LIUP,et al.Development of anovel quantitativerealtimeassay using duplex mutation primersfor rapid detection of Chlamydiatrachomatis［J］.Mol Med Report,2012,5(1)：207-210.