厌氧分解木质纤维素水解残渣中难降解性糖类研究

朱 桃， 祝其丽， 李 强 ， 汤晓玉， 赵昆炀， 吴 波

(农业部沼气科学研究所， 成都 610041)

在全球能源危机和油价不断上涨的大背景下，各国寻找新能源的脚步也前所未有地加快，其中生物燃料因有利于经济发展、环境保护和能源安全而备受关注[1]。木质纤维素是自然界中来源最丰富的可再生生物质资源之一[2]，通过生物炼制将其转化为生物燃料和化学品是近年来各国的研究热点[3]。

目前，对基于生物转化的木质纤维素生物炼制过程，无论采用酸性或者碱性预处理，都面临纤维素水解不完全的问题。研究表明，木质纤维素中约有22%的聚糖不能通过酶水解被转化利用[4]。这部分极难被降解的聚糖大量存在于水解残渣中，显著降低了纤维素的糖得率，从而影响了整个生物炼制过程的经济性。进一步降解和利用水解残渣中的这部分难降解性糖类，可以有效提高木质纤维素的糖利用率，同时有助于水解残渣的高值转化。实际上水解残渣中除糖以外还含有大量的木质素，这些木质素是天然的芳香化合物来源，可进一步升级为高附加值的生物燃料、精细化学品和生物基材料[5-6]。有效地去除水解残渣中存在的难降解性糖类是木质素高效转化的必要前提。近几年来研究者们致力于寻找木质素的提取方法，如加入酸或碱作为催化剂[7]。但这些提取方法会不同程度地破坏木质素的天然结构，且不能将糖进行转化利用。有机溶剂等方法也存在成本过高、溶剂难以回收以及溶剂有毒性等问题。因此本研究采用了厌氧分解的生物方法，将水解残渣中难降解性糖类在厌氧条件下进行分解并转化为沼气，同时富集木质素。

目前，有关水解残渣中难降解性糖类厌氧分解的研究甚少，大多数研究考察的都是秸秆等木质纤维素中纤维素和半纤维素的厌氧降解性能[8-9]。Prasad Kaparaju[10]等利用小麦秸秆产醇或联产醇气后的残渣进行沼气化利用，但未涉及残渣中聚糖的厌氧分解研究。Christa[4]等系统地研究了水解残渣中难降解性糖类的分子结构信息。本文重点考察了不同厌氧消化条件下水解残渣中难降解性糖类的降解规律、聚糖厌氧分解产甲烷的潜力及其碳利用率。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验研究的木质纤维素原料为玉米秸秆水解残渣，其制备流程如下：玉米秸秆→氨纤维爆破预处理→酶水解→水洗→干燥备用。其主要成分如前所述[11]。水解残渣的TS和VS分别为97.55%和68.87%。

本实验采用的接种污泥为餐厨垃圾厌氧消化液[11]，用80目筛子过滤去除大颗粒物质后，放入恒温培养箱进行发酵直至不再产气为止，作为厌氧消化的接种物。中温消化时，接种物的TS为0.86%，VS为0.52%。高温消化时，接种物的TS为0.73%，VS为0.47%。

1.2 实验方法

本实验采用批次厌氧消化的方法，用600 mL的血清瓶作为厌氧消化瓶，有效体积为350 mL，通过恒温培养箱控制温度。采用不添加底物的接种物作为空白对照，并设置三个平行样；每个接种比例的实验组设置两个平行样。水解残渣的净产气量为实验组(水解残渣+接种物)产气量减去空白对照(接种物)产气量。接种后将消化液的pH值调节到7.0±0.1，再将消化瓶加塞密封并充氮气5 min，排出瓶内的空气，以确保瓶内为厌氧环境。

厌氧消化实验时接种物和底物的比例(基于VS)分别设置为2∶1，1∶1，0.5∶1，0.25∶1，装瓶时保持接种物的添加量不变，改变底物的添加量以实现不同的接种比例。35℃和55℃的接种物添加量分别为0.52%和0.47%(基于VS)。定期取样测量沼气产量和甲烷含量。

1.3 分析方法

沼气产量通过压力法进行测量。甲烷含量采用气相色谱测定，色谱仪型号为上分GC122，色谱柱为碳分子筛TDX-01(2 m×2 mm)，采用TCD检测器，色谱条件如下：柱温120℃，进样器温度120℃，检测器温度150℃，载气为H2，气体压力为0.38 MPa，进样体积500 μL。

玉米秸秆水解残渣和厌氧消化残渣成分分析按照美国国家可再生能源实验室(NERL)的标准方法[12]进行。先将烘干的固体采用稀硫酸溶液进行水解，再用高效液相色谱仪(Agilent LC1200)分析水解液中的葡萄糖和木糖，所用色谱柱为Aminex HPX-87H，采用RID检测器，色谱条件如下：柱温35℃，流动相5 mmol·L-1硫酸溶液，流速0.6 mL·min-1，进样量20 μL。酸不溶木质素和灰分采用差重法测定[13]。

玉米秸秆水解残渣和厌氧消化残渣的有机元素(C，H，O，N)采用有机元素分析仪(Elementar Vario EL cube)进行分析。

2 结果与讨论

2.1 不同厌氧分解条件下水解残渣中聚糖含量变化

为了考察厌氧分解水解残渣中难降解性糖类的效果，研究了不同温度和接种比例条件下水解残渣中聚糖含量的变化。厌氧分解前后水解残渣中的主要聚糖(葡聚糖和木聚糖)的含量如图1～图4所示。水解残渣中葡聚糖和木聚糖含量分别为14.36%和4.22%。由图可知，接种物的聚糖含量在厌氧消化过程中几乎没有变化，而不同分解条件下水解残渣中的葡聚糖和木聚糖含量均有所降低。在相同的温度下，厌氧消化残渣中葡聚糖和木聚糖的含量都随着接种比例的增大而降低。在中温(35℃)条件下，当接种比例从0.25∶1升高至2∶1时，厌氧消化残渣中葡聚糖含量从8.30%降低到3.77%，木聚糖含量从2.29%降低到1.18%。但当接种比例低于或等于0.5∶1时，木聚糖含量不再变化。高温发酵(55℃)条件下，厌氧消化残渣中聚糖含量的变化趋势与中温条件相同。随着接种比例的升高，厌氧消化残渣中葡聚糖含量从6.88%降低至4.09%，木聚糖含量从1.70%降低至1.06%。由此可见，接种比例越高，厌氧消化残渣中难降解性聚糖的含量越低，说明厌氧降解的程度越高。但从经济性的角度考虑，接种比例不能无限提高。对比中温和高温条件，在相同的接种比例时，高温下厌氧消化残渣中葡聚糖和木聚糖的含量均低于中温(2∶1除外)。当采用2∶1的比例时，厌氧消化残渣中两个温度下葡聚糖和木聚糖含量相当，分别为4%和1%左右。这可能是因为此时水解残渣中降解性聚糖的厌氧分解已经达到瓶颈，难以被进一步降解。总的来说，采用高温条件(55 ℃)和较高的接种比例(2∶1)，难降解性聚糖的厌氧降解更为彻底。结果表明，在优化的工艺条件下，采用厌氧分解的方法可以将玉米秸秆酶水解残渣中的残糖降低至较低水平。

2.2 不同厌氧分解条件对水解残渣中聚糖降解率的影响

不同温度和接种比例条件下，水解残渣中葡聚糖和木聚糖的厌氧降解率如图5所示。由于厌氧消化后，水解残渣和接种物混合在一起，较难采用物理方法分离，故：

图1 35 ℃条件下厌氧分解前后的葡聚糖含量

图2 35 ℃条件下厌氧分解前后的木聚糖含量

图3 55 ℃条件下厌氧分解前后的葡聚糖含量

图4 55 ℃条件下厌氧分解前后的木聚糖含量

降解率=[水解残渣中聚糖质量-消化残渣中聚糖质量+消化后接种物中的聚糖质量]/水解残渣中聚糖含量×100%

不同厌氧分解条件下聚糖的降解率如图所示。在同一温度下，消化残渣中葡聚糖和木聚糖的降解率随着接种比例的增大而升高，且木聚糖的转化率高于葡聚糖。当接种比例等于或者小于0.5∶1时，木聚糖的转化率基本不再变化。这与厌氧消化残渣中木聚糖的含量变化趋势一致。中温和高温条件下，聚糖降解率随接种比例的变化趋势相同。但高温条件下，葡聚糖和木聚糖的降解率均略高于中温条件。55 ℃条件下，接种比例RI/S为2∶1时，葡聚糖和木聚糖的降解率最高，分别为54%和76%。说明在优化的厌氧分解条件下，水解残渣中约有一半以上的葡聚糖和3/4的木聚糖被降解，为后续水解残渣的纯化奠定了基础。本实验结果与Yun Hu[8]等用玉米秸秆在沼液的不同循环方式下做厌氧消化时纤维素和半纤维素降解率变化相似，纤维素和半纤维素的降解率不仅在数值上与本实验中葡聚糖和木聚糖的降解率接近，半纤维素的降解率高于纤维素这一结果还与本实验中木聚糖的降解率高于葡聚糖相同。

图5 不同温度和接种比例下聚糖的降解率

2.3 不同厌氧分解条件下水解残渣的产气情况

水解残渣中的聚糖经过厌氧分解后，被进一步转化为沼气。不同温度和接种比例条件下，水解残渣的产甲烷情况如图6和图7所示。由图6和图7可知，在考察的温度和接种比例条件下，各实验组都能正常产气。总体上，在同一温度下累积甲烷产量随着接种比例的增大而逐渐升高，这与郗登宝[14]等研究不同接种量对玉米秸秆厌氧消化产气的影响，以及Yan Li[15]等研究接种比例对藻渣厌氧消化性能的影响时的变化规律一致。相同接种比例的条件下，水解残渣高温时的产气速率明显高于中温消化。高温消化大约在10天左右产气就进入平缓期，此时各接种比例下水解残渣的累积甲烷产量基本达到最终甲烷产量的75%左右，而中温消化时达到相同的产量则需要34 d以上。高温条件下，沼气发酵在接种后的第2天就迅速开始启动，各发酵样品即有大量甲烷产生，在后续的3～5 d日产气量达到峰值，说明大部分难降解性聚糖在这个时期被水解细菌迅速分解，并转化为沼气。相比之下，中温条件下的产气速率更慢，可能与水解菌的活性有关。从厌氧分解难降解性聚糖的角度来看，高温条件更为适合。

2.4 水解残渣厌氧分解过程的甲烷产量和碳利用率

不同温度和接种比例条件下，水解残渣的最终甲烷产量以及碳利用率如表1所示。

碳利用率=累积甲烷中的碳质量/[消化前接种物中的碳质量+水解残渣中的碳质量]× 100%。

从表1中可以看出，在相同的温度下，最终甲烷产量随着接种比例的减小而降低。碳利用率也随着接种比例的减小而降低。这与前述的聚糖含量的变化一致。接种比例越小，厌氧分解后剩余的聚糖含量越高，水解残渣中有机碳转化为甲烷的效率越低，最终甲烷产量也就越低。在相同接种比例条件下，水解残渣高温消化的最终甲烷产量和碳利用率均高于中温消化，这与图1中高温消化条件下水解残渣厌氧分解后聚糖含量低于中温消化，以及图2中高温消化条件下水解残渣厌氧分解过程中聚糖的降解率高于中温消化的结果相符合。本实验的结果大多数低于冯雪梅[9]等研究藻渣添加对玉米秸秆厌氧消化特征的影响时的最终甲烷产量18.7～218.7 mL·g-1VS，除了是因为添加藻渣能显著提高厌氧消化体系的产气效率之外，也可能是因为接种物种类、接种比例和发酵底物的不同。在中温消化和相同接种比例的对照组中，水解残渣的最终甲烷产量大部分低于Yan Li[15]等用藻渣做厌氧消化时的最终甲烷产量26.6～210.6 mL·g-1VS，这可能是因为接种物餐厨垃圾厌氧消化液的高氨氮浓度抑制了水解残渣厌氧消化的产甲烷过程。此外，在中温消化条件下，接种比例RI/S(基于VS)为0.5∶1时，水解残渣厌氧分解后的最终甲烷产量与Heng Li[16]等用玉米秸秆做厌氧消化时的最终甲烷产量145±28 mL·g-1VS较为接近，这表明水解残渣的产甲烷潜力与玉米秸秆等木质纤维素原料接近。

图6 35 ℃条件下水解残渣厌氧分解过程的累积甲烷产量

图7 55 ℃条件下水解残渣厌氧分解过程的累积甲烷产量

表1 不同温度和接种比例下水解残渣的产气性能和碳利用率

3 结论

(1)采用厌氧分解的方法可以有效地降低木质纤维素水解残渣中难降解性糖类的浓度。厌氧分解后的聚糖含量随接种比例的增大而降低，聚糖降解率随接种比例的增大而升高，高温条件下的降解程度高于中温条件，木聚糖的降解率略高于葡聚糖。在高温消化和接种比例为2∶1时，水解残渣中聚糖降解效果最佳，厌氧分解后葡聚糖和木聚糖的含量分别降低至4%和1%左右。

(2)水解残渣中难降解性糖类厌氧分解后转化为沼气。其最终甲烷产量随接种比例的增大而升高；高温条件下的最终甲烷产量、产气速率和碳利用率均高于中温条件。水解残渣厌氧分解的甲烷产量最高可达184.70 mL·g-1VS。

(3)本研究成果可以为木质纤维素生物炼制过程水解残渣的回收利用提供新的途径，同时也为研究木质纤维素中难降解性糖类的降解问题奠定了基础。

参考文献：

[1] Balat M. Production of bioethanol from lignocellulosic materials via the biochemical pathway: A review[J]. Energy Conversion and Management, 2011,52(2):858-875.

[2] Amin FR, Khalid H, Zhang H, et al. Pretreatment methods of lignocellulosic biomass for anaerobic digestion[J]. AMB Express, 2017,7(1):72.

[4] Gunawan C, Xue S, Pattathil S, et al. Comprehensive characterization of non-cellulosic recalcitrant cell wall carbohydrates in unhydrolyzed solids from AFEX-pretreated corn stover[J]. Biotechnology for biofuels, 2017,10:82.

[5] Ma R, Xu Y, Zhang X. Catalytic oxidation of biorefinery lignin to value-added chemicals to support sustainable biofuel production[J]. ChemSusChem, 2015,8(1):24-51.

[6] Upton B M, Kasko A M. Strategies for the Conversion of Lignin to High-Value Polymeric Materials: Review and Perspective[J]. Chem Rev, 2016,116(4):2275-2306.

[7] Mosier N, Wyman C, Dale B, et al. Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass[J]. Bioresource technology, 2005,96(6):673-686.

[8] Hu Y, Shen F, Yuan H, et al. Influence of recirculation of liquid fraction of the digestate (LFD) on maize stover anaerobic digestion[J]. Biosystems Engineering, 2014,127:189-196.

[9] 冯雪梅, 王 进, 彭书传, 等. 藻渣添加对玉米秸秆厌氧发酵特征的影响[J]. 环 境 工 程 学 报, 2015,9(6):2968-2990.

[10] Kaparaju P, Serrano M, Thomsen AB, et al. Bioethanol, biohydrogen and biogas production from wheat straw in a biorefinery concept[J]. Bioresource technology, 2009,100(9):2562-2568.

[11] 陈世平, 汤晓玉, 肖泽仪, 等. 玉米秸秆水解残渣厌氧消化的产气性能[J]. 农业环境科学学报, 2016,35(3):584-589.

[12] National Renewable Energy Laboratory, Inc.Standard Procedures for Biomass Compositional Analys [EB/OL]. http://www.nrel. gov/ biomass/analyticl_procedures. html，2015-7-11.

[13] 杜 静, 陈广银, 黄红英, 等. 温和湿热预处理对稻秸理化特性及生物产沼气的影响[J]. 中国环境科学, 2016,36(2):485-491.

[14] 郗登宝, 黄 枭, 邱 鑫, 等. 不同接种量对玉米秸秆厌氧发酵产气的影响[J]. 现代农业科技, 2013(9):213.

[15] Li Y, Hua D, Zhang J, et al. Influence of inoculum to substrate ratios (ISRs) on the performance of anaerobic digestion of algal residues[J]. Annals of Microbiology, 2013,64(3):955-960.

[16] Li H, Tan F, Ke L, et al. Mass balances and distributions of C, N, and P in the anaerobic digestion of different substrates and relationships between products and substrates[J]. Chemical Engineering Journal, 2016,287:329-336.