氨基酸对猪手工克隆重构胚胎发育效果的影响

吕玲燕 陈宝剑 吴永绍 孙如玉 汪燕玲 马青艳 潘天彪

摘要：为了探讨氨基酸对猪手工克隆（HMC）重构胚发育效果的影响，比较了必需氨基酸（EAA）和非必需氨基酸（NEAA）对卵母细胞的成熟状况以及对猪HMC重构胚胎发育潜能的影响。结果表明，成熟培养液中添加EAA、NEAA及EAA+NEAA之间的成熟率差异不显著，但均显著高于空白对照组（P<0.05）；胚胎培养液中添加EAA、NEAA及空白对照组的卵裂率都显著高于EAA+NEAA（P<0.05）；囊胚率及细胞总数，NEAA组显著高于空白对照组及EAA+NEAA组、EAA组（P<0.05）。

关键词：氨基酸；猪；重构胚胎；发育效果

中图分类号：S828 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）06-0108-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.06.027

Abstract： Effect of developmental potency of reconstructed embryos on pig handmade clone（HMC） of amino acid was investigated. In this study，we compared with the effect of the essential amino acid（EAA） and the essential amino acid （NEAA） on oocyte maturation rate and porcine HMC reconstructed embryos developmental potency. The results showed that the difference of maturation rate was not significant between the group of EAA，NEAA and EAA+NEAA in maturation medium，yet was significantly higher than the control group（P<0.05）；the cleavage rate of EAA group， NEAA group and the control group was significantly higher than EAA+NEAA group in embryo culture medium（P<0.05），as for the blastocyst rate and the total number of cells，the group of NEAA was significantly higher than the group of control， EAA+NEAA，EAA（P<0.05）.

Key words： amino acid；porcine；reconstructed embryos；developmental potency

随着猪胚胎工程的发展，可以改良品种、培育抗病猪种、提高肉质、生产转基因猪或基因组修饰猪、制备人类疾病模型、进行器官移植、生产药物蛋白、研究发育机理等[1]。胚胎的体外培养是猪胚胎工程的主要环节之一，无论是体外受精（IVF）、核移植技术还是基因敲除，所生产的胚胎都要经过体外培养，发育到适当的阶段才能进行后续的研究。影响猪胚胎体外发育的因素有很多，比如渗透压大小[2]、氧化应激反应[2]、螯合剂[3]、能量基质、氨基酸[4]等。而其中卵母细胞体外培养的成熟情况又是至关重要的，直接影响到后期胚胎的发育。有关氨基酸对猪卵母细胞的体外成熟及早期胚胎体外发育效果影响的报道鲜见，本试验探讨不同氨基酸浓度对猪卵母细胞体外成熟效率以及对手工克隆重构胚胎发育效果的影响，从而优化猪HMC的技术体系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 胎牛血清（FBS）、TCM-199粉剂、DMEM粉剂购置于美国Gbico公司，激素eCG、hCG购置于美国Sigma公司，其他化学试剂如无特殊说明均购置于美国Sigma公司。

1.1.2 仪器 细胞融合仪型号：ECM2001、融合槽型号：BTX 450、胚胎积聚针型号：DN-10式、卵母细胞成熟培养皿：35 mm及60 mm 塑料平皿、去核切割刀自制、胚胎培养皿：四孔板。

1.2 方法

1.2.1 卵母细胞的成熟培养 取卵巢表面2～6 mm的卵泡，于试管中静置，弃去上清，留沉淀部分分装。挑选含有3层及以上有颗粒/卵丘细胞包被、折光性良好的卵丘卵母细胞复合体（COCs），放入成熟液中（含10 IU/mL hCG+10 IU/mL eCG）培养，将卵母细胞随机分成4组：①空白對照组；②添加2%必需氨基酸（EAA）；③添加1%非必需氨基酸（NEAA）；④同时添加2%必需氨基酸（EAA）和1%非必需氨基酸（NEAA），20～22 h后换成不含激素的培养液，继续培养18～20 h至细胞成熟。

1.2.2 供体细胞的处理 分离出胎猪大腿组织，将其剪碎至2～3 mm的组织块，加入少量含10% FBS的DMEM培养液，均匀铺开，在皿盖做好标记，将其倒扣于培养箱中，4 h后加入少量培养液，防止组织块漂浮。24 h后在平皿底部加满培养液，48 h后继续观察成纤维细胞的生长状况，待成纤维细胞生长至90%左右汇合度时，进行传代培养，用作猪手工克隆供体细胞。

1.2.3 重构胚的构建、培养以及囊胚细胞计数 将带核的卵母细胞置于含2.5 μg/mL CB的切割液中去核，等其恢复成圆形后，与已处理好的供体细胞进行黏合，形成卵-供体-卵式的黏合体（形成三角状），移入电融合液中进行一步融合，参数为AC：6 V/cm；DC：1.2 kV/cm，30 μs，2 DC，电激活后放入培养箱中恢复30 min，然后检查其融合/激活情况。将融合后的重构胚放入PZM-3中激活，其含5 μg/mL CB和10 μg/mL CHX，每滴激活液中放入1枚重构胚，激活4 h。胚胎培养随机分成4组：①空白对照组； ②添加2%必需氨基酸（EAA）；③添加1%非必需氨基酸（NEAA）；④同时添加2%必需氨基酸（EAA）和1%非必需氨基酸（NEAA）。48 h观察卵裂率，160～168 h观察囊胚率。在培养后6～7 d收集囊胚，置于Hoechst 33342染液中，石蜡-凡士林封片，荧光显微镜下观察记录囊胚细胞总数目。

1.3 统计分析

所得数据由SPSS17.0软件进行统计分析，试验每重复1次均为同1批次试验，使用相同来源的卵巢和试验条件，所有试验至少重复4次。

2 结果与分析

2.1 EAA、NEAA及EAA+NEAA对卵母细胞成熟效率的影响

卵母细胞的成熟培养液中添加EAA及NEAA，浓度分别为2%EAA、1%NEAA、2%EAA+1%NEAA，培养40～44 h。试验结果表明，添加2%EAA组、1%NEAA组及2%EAA+1%NEAA组之间的差异不显著，但均显著高于空白对照组，结果见表1及图1。

2.2 EAA、NEAA及EAA+NEAA对重构胚发育效果的影响

胚胎培养液中添加EAA及NEAA，浓度分别为2%EAA、1%NEAA、2%EAA+1%NEAA，培养160～168 h。试验结果表明，添加2%EAA组、1%NEAA组及空白对照组的卵裂率显著高于2%EAA+1%NEAA组（P<0.05）；就囊胚率及细胞总数而言，1%NEAA组显著高于空白对照组及2%EAA+1%NEAA组、1%EAA组（P<0.05），结果见表2及图2。

3 讨论

氨基酸的主要生理作用主要包括合成蛋白质和核苷酸、提供营养和能量、调节渗透压，抗氧化、调节pH、信号转导分子的生物合成，以及参与滋养外胚层分化和内外胚层之间基膜形成[6]。虽然对氨基酸代谢机制的研究取得了一定的进展，但其确切的作用机理尚不明了，添加氨基酸是否对猪卵母细胞、胚胎的体外培养有利一直存在争议[5，7-9]。

就氨基酸对卵母细胞的成熟作用而言，侯文文[8]研究表明，不同浓度必需氨基酸和非必需氨基酸添加到猪卵母细胞体外成熟培养液中，发现在成熟率上，试验组与对照组都没有显著差异（P>0.05）。马红等[9]研究表明在卵母细胞的成熟培养液中添加1%EAA、1%NEAA及1%EAA+1%NEAA均能提高卵母细胞在体外的成熟率，且都显著高于空白对照组（P<0.05），本试验的研究成果与马红等[9]得出的结论相一致。

就氨基酸对胚胎体外发育效果作用而言，信吉阁等[10]研究表明在胚胎培养液中添加氨基酸能提高猪孤雌激活胚胎的卵裂率、囊胚率及囊胚细胞总数，且明显高于空白对照组。郑云胜等[11]研究表明，绵羊胚胎体外培养时，NEAA和EAA具有互补性，NEAA促进囊胚以前的发育，EAA促进囊胚以后的发育。成俊萍等[12]研究表明，NEAA可显著提高水牛卵母细胞IVF后胚胎的分裂率，但对囊胚发育率无显著影响，低浓度的EAA对水牛IVF胚胎的发育具有一定促进作用，但高浓度则有抑制作用。结果表明，成熟培养液中添加EAA、NEAA及空白对照组的卵裂率都显著高于EAA+NEAA组（P<0.05），这可能是由于EAA和NEAA之间的相互作用，产生的某些化学物质降低了HMC重构胚发育的卵裂率；就囊胚率及细胞总数而言，NEAA组显著高于空白对照组及EAA+NEAA组、EAA组（P<0.05），这与前人的研究结果基本保持一致。在胚胎发育的不同阶段对氨基酸的需求量是不同的，EAA虽对早期分裂胚胎有抑制作用，但对8～16细胞之后的胚胎发育没有任何不利影响，而NEAA在8～16细胞至囊胚阶段，对哺乳动物胚胎发育也有促进作用[13]。另外必需氨基酸和非必需氨基酸种类很多，它们相互之间及其与培养液中其他成分的作用比较复杂，只有充分了解他们之间的相互作用，以及卵母细胞和胚胎各个发育时期对氨基酸的需求量，才能更有效地调整培养条件以期提高HMC重构胚胎的体外发育能力。

参考文献：

[1] LAI L X，KOLBER-SIMONDS D，PARK K W，et al. Production of α-1，3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning[J].Science，2002，295（5557）：1089-1092.

[2] BAVISTER B D. Culture of preimplantation embryos：Facts and artifacts[J].Human Reproduction Update，1995，1（2）：91-148.

[3] ABRAMCZUK J，SOLTER D，KOPROWSKI H. The beneficial effect of EDTA ondevelopment of mouse one-cell embryos in chemically defined medium[J].Developmental Biology，1977，61（2）：378-383.

[4] PETTERS R M，JOHNSON B H，REED M L，et al. Glucose，glutamine and inorganic phosphate in early development of the pig embryo in vitro[J].Journal of Reproduction and Fertility，1990，89（1）：269-275.

[5] YOSHIOKA K，SUZUKI C，TANAKA A，et al. Birth of piglets derived from porcine zygotes cultured in a chemically defined medium[J].Biology of Reproduction，2002，66（1）：112-119.

[6] HONG J，LEE E. Intrafollicular amino acid concentration and the effect of amino acids in a defined maturation on porcine oocyte maturation fertilization，and preimplantation development[J].Heriogenology，2007，68（5）：728-735

[7] LONG C R，DORBRINSKY J R，JOHNSON L A. In vitro production of pig embryos：Comparision of culture media and boars[J]. Theriogenology，1999，51（7）：1375-1390.

[8] 侯文文.豬卵母细胞体外成熟及胚胎培养的相关研究[D].合肥：安徽农业大学，2009.

[9] 马 红，付 博，李忠秋，等.氨基酸对猪卵母细胞成熟及重构胚发育的影响[J].中国兽医学报，2014，34（6）：991-994.

[10] 信吉阁，卿玉波，成文敏，等.CB·氨基酸在猪卵母细胞孤雌激活及体外培养中的作用[J].安徽农业科学，2012，40（22）：11330-11332.

[11] 郑云胜，张家新，陈玉琦，等.氨基酸和牛磺酸对绵羊体外受精胚胎体外培养的影响[J].中国畜牧杂志，2004，40（3）：16-18.

[12] 成俊萍，陆风花，王晓丽，等.氨基酸、维生素对水牛体外受精胚胎体外发育的影响[J].中国兽医学报，2010，30（2）：278-281.

[13] LIU Z，FOOTE R H.Effects of amino acids on the development of IVM/IVF bovine embryos in a simple protein-free medium[J].Theriogenology，1996，45（11）：2985-2991.