仔猪腹泻大肠杆菌分离鉴定及血清型与耐药性分析

吴利军 周丹娜 邵志勇 金尔光 姚艳丰 王富国 陈夏冰 何斌 杨文海 刘武 童伟文 夏瑜 陈洁

摘要：为明确湖北省一规模化猪场暴发新生仔猪腹泻疫情的病因及病原特点，对采集的仔猪腹泻样品进行了大肠杆菌（Escherichia coli）的分离培养、生化试验、血清型鉴定和耐药性分析。结果表明，从仔猪腹泻样品中分离鉴定出22株大肠杆菌。对分离株进行血清型鉴定，共出现19株定型，分属于O4、O38、O55、O76、O119 5个血清型，其中O4、O55、O119为优势血清型；药敏测试结果显示，分离菌株均为多重耐药株，最少对6种药物耐受，最高达19种。分离株对20种抗生素的耐药率为13.6%～95.5%。敏感性最高的抗菌药物为磷霉素，敏感率为77.3%；检测获得的猪场仔猪腹泻大肠杆菌的血清型和耐药谱基本数据，为制定有针对性地治疗和防控方案提供了依据。

关键词：新生仔猪；腹泻；大肠杆菌（Escherichia coli）；血清型鉴定；耐药性

中图分类号：S857.3+1：S852.61+7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）06-0094-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.06.023

Abstract： In order to investigate the causative agents and pathogenic characteristics of newborn piglets diarrhea outbroke in a large scale pig farm of Hubei province， the study was carried out to isolate and identify Escherichia coli from the feces of diarrheal piglets and the serotype， biochemical test and drug resistance test were conducted. The results showed that 22 strains of E. coli have been isolated from the feces samples. Serological identification results showed that 19 strains were serotyped and belonged to 5 serotypes， including O4， O38， O55， O76， O119， among which the predominant serotypes were O4， O55， O119. Drug resistance analysis showed that all of the strains were multiple drug resistance. The isolates showed the least resistance to 6 kinds of antibiotics， the most resistance to 19 kinds of antibiotics. The drug resistance rate of isolates to 20 antibiotics ranged from 13.6% to 95.5%. The most sensitive antibiotic was fosfomycin and sensitive rate reached to 77.3%. In summary， our results provided the fundamental date of serotype and drug resistance of the E.coli isolates， which provided the scientific data for clinical treatment and prevention and control of diarrhea diseases in this farm.

Key words： newborn piglet； diarrhea； Escherichia coli； serotype identification； drug resistance

近年來，仔猪腹泻成为严重危害中国乃至全球养猪业的常发性疾病之一。仔猪腹泻病可造成仔猪生长发育受阻，增重缓慢，死亡率升高，给养猪业造成了巨大的经济损失[1]。引发仔猪腹泻的病原菌主要包括大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒等[2，3]。其中致病性大肠杆菌是引发仔猪腹泻的重要病原之一，而引发新生仔猪腹泻的大肠杆菌主要是肠毒素性大肠杆菌（ETEC），临床上主要表现为仔猪黄白痢[4]。目前，仔猪黄白痢的防治仍然以抗菌药物为主，但随着抗菌药物的大量使用和不合理应用，造成大肠杆菌的耐药性逐渐增强，而耐药菌株的流行又使得新生仔猪腹泻更加难以防控[5]。2017年8月，湖北省一规模化猪场发生新生仔猪腹泻，临床表现为仔猪脱水、腹泻、排黄白色液体稀便，根据临床症状及流行特点初步判定为大肠杆菌病。试验从发病猪场腹泻仔猪粪便样品中分离出致泻性大肠杆菌流行株，并对分离株进行生化鉴定、血清型鉴定和耐药性分析，以期为探明导致仔猪腹泻的病原特征和临床用药提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 用无菌棉拭子通过腹泻新生仔猪肛门采集粪便样品33份，放入带冰保温箱中带回实验室，于24 h内进行细菌的分离培养。

1.1.2 主要试剂与药物 胰蛋白大豆肉汤（TSB）、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、生化试验微量发酵管、药敏纸片均购自杭州微生物试剂有限公司；大肠杆菌标准O抗原单因子血清购自天津生物芯片技术有限公司；DL2000 DNA Maker、Premix Taq购自Takara公司。药敏测试所用的抗菌药物有环丙沙星、四环素、红霉素、利福平、氧氟沙星、诺氟沙星、头孢他啶、氨苄西林、头孢噻肟、头孢曲松、链霉素、氯霉素、庆大霉素、头孢氨苄、磷霉素、头孢呋辛、阿莫西林、氟苯尼考、林可霉素、新霉素，均由武汉市农业科学院提供。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离鉴定与纯化 无菌操作取肛拭子样品直接划线于麦康凯琼脂平板上，37 ℃培养24 h，挑取疑似大肠杆菌菌落连续纯培养3代。将纯化后的细菌进行革兰氏染色，镜检，并划线于伊红美蓝琼脂平板上，观察菌落形态及染色特征。

1.2.2 生化特性鉴定 将纯化好的大肠杆菌接种于TSB培养基上，37 ℃培养18～24 h后取适量分别接种于葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、靛基质、VP、MR、西蒙氏枸橼酸盐、尿素酶、硫化氢生化管中，37 ℃培养24 h后观察生化反应结果。靛基质滴加靛基质试剂、MR滴加MR试剂1滴观察结果。VP滴加VP甲液2滴、VP乙液1滴，置37 ℃培养2 h后观察结果。

1.2.3 大肠杆菌O抗原血清型鉴定 从经鉴定为大肠杆菌的麦康凯琼脂平板上挑取单菌落于5 mL 的TSB液体培养基中，37 ℃、220 r/min、过夜摇菌18 h，8 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入等体积的含0.5%石炭酸的生理盐水重悬，经过121 ℃高压灭菌2 h，破坏菌体的K抗原即为制备的O抗原。取10 μL冷却的菌液和10 μL的O抗原单因子血清，在玻板上混匀，1 min之内出现明显凝集的为阳性反应，同时取生理盐水与待检抗原参照上述方法混合均匀，观察有无自凝集现象。

1.2.4 药敏试验 利用K-B涂布法测定分离菌株对20种常见抗菌药物的敏感性，药敏结果判定依据美国临床和实验室标准协会标准（NCCLS）执行。

1.2.5 16S rRNA序列鉴定 设计合成一对细菌16S rRNA基因通用型檢测引物（F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）。采用菌液PCR对大肠杆菌分离菌株基因组DNA进行PCR扩增。PCR扩增体系包括：DNA模板1.0 μL菌液，Premix Taq 10.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，补ddH2O至25.0 μL。PCR扩增程序为95 ℃、 5 min；95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、90 s，30个循环；72 ℃、10 min。PCR扩增产物经回收、纯化后送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，将测序结果通过BLAST与GenBank中登录的细菌基因组16S rRNA序列进行比对分析。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离与鉴定

疑似大肠杆菌的细菌分离结果见图1。从图1可知，经37 ℃培养18 h后，分离菌在麦康凯琼脂上形成圆形、光滑、边缘整齐、隆起的粉红色菌落（图1-A）；在伊红美蓝琼脂上形成紫黑色、具有金属光泽的小菌落（图1-B）。取纯培养物涂片，革兰氏染色，镜检可见到革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌（图1-C）。而且22株细菌的培养特性和形态特征均符合大肠杆菌的描述。

2.2 生化特性鉴定

对分离出的22株细菌分别进行了生化试验检测，结果见表1。从表1可知，检测结果均符合大肠杆菌的生化特性。

2.3 血清型鉴定结果

对22株分离的大肠杆菌进行血清型鉴定，结果见表2。从表2可知，22株大肠杆菌菌株有19株可定型，分属于O4、O38、O55、O76、O119 5个血清型，其中O4、O55、O119为优势血清型；另有3株大肠杆菌菌株为未定型。

2.4 药敏试验

用20种常用抗菌药物对22株大肠杆菌分离株进行药敏试验，结果见表3。从表3可以看出，分离菌株对很多抗菌药物产生了很强的耐药性，其中对四环素、红霉素、利福平、链霉素、阿莫西林和林可霉素的耐药率达到了90%以上；环丙沙星、氨苄西林、氯霉素和庆大霉素的耐药率达到80%以上；敏感性最高的抗菌药物为磷霉素，敏感率为77.3%；其他几种药物也存在不同程度的耐药性。对大肠杆菌进行多重耐药性分析，结果见图2。从图2可知，22株分离的大肠杆菌对所供试的20种抗菌药物均表现为严重的多重耐药。所有菌株至少对6种药物耐受，最高的达到19耐。其中6耐、10耐菌株所占比例都为4.5%；13耐、14耐、17耐和19耐菌株所占比例都为9.1%；8耐、12耐、15耐和18耐菌株所占的比例都为13.6%。

2.5 16S rRNA序列鉴定

对分离菌株进行16S rRNA通用型引物扩增，部分结果如图3。从图3可见，在大小约为1 500 bp处具有特异性扩增条带，与试验预期结果相符，PCR扩增条带经过测序表明为大肠杆菌16S rRNA基因特异性序列。

3 讨论

近年来，随着集约化养猪业的发展，由致病性大肠杆菌引起的仔猪黄白痢死亡率增高，成活率降低，断奶窝重降低，严重影响了养猪业的健康发展[6]。由于该病的耐药性日益严重，由耐药菌株引起的临床感染发病率和死亡率逐渐升高。因此，开展针对性的流行病学监测是目前集约化养猪生产中有效防控该病的重要手段。试验从湖北省一规模化猪场发生仔猪腹泻的粪便样品中分离出22株细菌，根据临床症状及病原菌的形态及生化鉴定，初步判定为仔猪大肠杆菌病。

引起仔猪腹泻的大肠杆菌血清型复杂，地区分布广泛，而且差异性较大。试验对分离出的22株大肠杆菌进行血清型鉴定，共有19株定型，主要为分属于O4、O38、O55、O76、O119 5个血清型，其中O4、O55、O119为优势血清型。国外研究表明，引起仔猪黄白痢的致病性大肠杆菌常见的O抗原血清型主要有O8、 O9、O45、O64、O101、O115、O138、O147、O149、O157等[7，8]。国内学者也相继报道了各省引起仔猪腹泻大肠杆菌的流行血清型[9，10]。而本试验鉴定的优势血清型O4、O55、O119与上述结果不是很符合，表明不同时期不同地区大肠杆菌的流行血清型不尽相同。为此，必须定期对猪场仔猪致病性大肠杆菌进行分离鉴定，然后选取与本场血清型相同的菌株制成的疫苗对母猪和仔猪进行预防。

目前，临床上广泛使用抗菌药物治疗大肠杆菌等细菌性疾病。但是由于过量使用抗菌药物导致大量耐药菌株出现。本试验用20种常用抗菌药物对22株大肠杆菌分离株进行了耐药性测试，结果所有菌株至少对6种药物耐受，最高达到19耐，。耐药性产生最强的抗生素是四环素、红霉素、利福平、链霉素、阿莫西林、林可霉素，耐药率均达到90%以上。敏感性最高的抗菌药物为磷霉素，敏感率为77.3%。说明从该猪场分离的大肠杆菌对抗菌药物的耐药性已经相当严重，并且以多重耐药性为主，这与国内方雨玲等[11]和郭潇木等[12]的报道基本一致。所以，猪场要定期对致病性大肠杆菌进行药敏监测，在治疗的过程中选择有效的药物和适当的剂量，并制定合理的治疗方案来控制仔猪大肠杆菌性腹泻。

仔猪腹泻病因复杂，主要包括传染性因素和非传染性因素。传染性因素包括细菌和病毒两大类致病因素，非传染性因素包括饲养管理水平、圈舍环境不良、刚断奶仔猪过度采食或者过度限饲等。因此，对于仔猪腹泻应及时送检病料，明确病因，采取综合措施进行预防和控制。试验通过对仔猪腹泻大肠杆菌分离鉴定及血清型与耐药性分析，掌握了该猪场引发仔猪腹泻的大肠杆菌优势血清型和耐药谱，为下一步制定有针对性的治疗和防控措施提供了依据。

参考文献：

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