水肥一体化条件下烤烟氮素营养高效利用研究

席奇亮，杨铁钊，周方，刘超，叶红朝，邢雪霞，赵科，孔德辉

1 河南农业大学烟草学院 郑州 450002;2 河南省洛阳市烟草公司 洛阳 471000

施用氮肥是农业生产中的重要措施，施氮方式对植株干物质积累和氮素吸收影响显著。长期不合理施用氮肥导致土壤酸化、板结、环境恶劣[1]，造成植株氮素利用率较低。有研究表明，我国部分地区作物氮素利用率仅有20%～30%[2]，因此，氮肥的合理精准施用，是促进作物氮素吸收与干物质积累，实现氮素营养高效利用的有效措施[3]。水肥一体化技术实现了水肥同步管理和水肥高效利用[4]，滴灌施肥作为一种最有效的水肥一体方式，具有节水、节肥、增效、省工的优点，在作物生产上已得到了广泛利用，并取得了很好的效果。侯振安等[5]研究了膜下滴灌水氮耦合对棉花干物质积累和氮素吸收规律的影响，表明膜下滴灌能有效增加花铃期根冠生物量、氮素吸收量、吐絮期地部上干物质量和氮素积累量，使氮素的利用效率提高了30.51%。谢志良等[6]和祁通等[7]的研究也有类似的结果。杜少平等[8]研究表明采用滴灌施肥能提高甜瓜的干物质积累量使甜瓜增产7.40%～14.35%，水、氮利用率分别提高28.81%～40.65%和22.78%～77.22%。

氮代谢是植物最基本的生理代谢过程之一，与碳代谢等协调统一共同成为植物生命活动的基本过程，硝酸还原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）被认为是高等植物氮代谢的关键酶类[9]，这些酶活性的强弱直接影响到植物对氮素的吸收，进而影响肥料的利用率和干物质积累量。岳红宾[10]比较了不同氮素水平下烤烟碳氮代谢关键酶活性的变化情况，发现随着氮素水平的提高，烟叶硝酸还原酶活性呈上升趋势。罗莎莎等[11]研究了氮肥基施与追施比例对烤烟光合特性及氮代谢关键酶活性的影响，结果表明硝酸还原酶（NR）和谷氨酰胺合成酶（GS）活性基本随着氮肥追施比例的增大而增加。

目前，水肥一体化技术在烤烟种植方面的应用方兴未艾，有关其对烤烟干物质积累和氮素吸收以及氮代谢关键酶活性影响的研究尚不多见。本文以滴灌施肥对烤烟生长发育的影响为切入点，比较常规施肥和滴灌施肥对烤烟干物质积累和氮素吸收的影响，测定了烤烟氮代谢2个关键酶活性及其相关基因的相对表达量，以期从生理和分子的角度阐释水肥一体化条件下烤烟氮素营养高效利用的机理，为该项技术制定施肥方案提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验区基本情况

试验于2015—2016年进行2年的田间试验，于2017年进行盆栽试验，均安排在河南省郑州市河南农业大学毛庄科教园区进行，当地海拔94 m，北纬N34°51′56.34″，东经E113°35′5.70″，位于华北平原南部，属北温带大陆季风性气候。试验地为偏砂质潮土，前茬作物为烤烟，土壤有机质含量 10.2 g·kg-1，全氮含量为 0.93 g·kg-1，速效磷含量为 11.2 mg·kg-1，速效钾含量 157.6 mg·kg-1。

1.2 试验材料与设计

田间试验和盆栽实验均设置3个处理， 即空白对照处理（用CK表示）、常规栽培处理（用FP表示）和水肥一体化处理（用DF表示）。供试烤烟品种为‘豫烟6号’，2015年于3月12日播种育苗，5月9日移栽；2016年于3月1日播种育苗，5月5日移栽；2017年于3月10日播种育苗，5月12日移栽。田间试验各处理小区面积均为667 m2，行株距为1.1 m×0.55 m，另设保护行，每个小区种植1000株，每个处理重复3次；盆栽试验用土取自田间试验地土壤，风干后过40目筛子，用盆高30 cm，直径35 cm，每盆装土20 kg，每个处理种10盆，周围摆放保护盆，以消除边行优势。田间试验和盆栽试验各处理除施肥方案不同外，其他栽培措施按优质烟生产技术规范进行。

田间试验3个处理具体施肥方案如下：CK处理不施用任何化肥，作为空白对照。FP处理在大田起垄时条施芝麻饼肥 225 kg/hm2、烟草专用复合肥（15-15-15）150 kg/hm2和有机无机一体肥（13-5-17）150 kg/hm2作基肥，硝酸钾（14-0-46）用量75 kg/hm2作为追肥在团棵期一次穴施，烟株全生育期总施氮量为52.5 kg/hm2。DF处理在大田起垄时条施芝麻饼肥225 kg/hm2做基肥，所有化肥作追肥通过水肥一体化滴灌系统根据烟株需肥需水规律施入，追肥采用本课题组研制的烟草专用液体套餐肥，其中包括烟草专用还苗生根肥（20-10-10）共75 kg/hm2，分别在烟株移栽时和移栽后20 d施入；旺长肥（25-15-10）共150 kg/hm2，分别在移栽后30 d和40 d施入；成熟落黄肥（0-0-40）共150 kg/hm2，分别在移栽后50 d和60 d施入，烟株全生育期施入氮磷钾总量与常规栽培处理保持一致。盆栽试验施肥方案与田间试验基本相同，所施肥料用量和灌水量均按照田间试验用量进行换算，保持一致。全生育期灌水量CK和FP处理与DF处理保持一致，其中CK和FP处理灌溉方式为漫灌，全生育期共进行3次灌溉，每次灌水定额为450 m3/hm2；DF处理灌溉方式为滴灌，全生育期共进行9次灌溉（其中6次与施肥同时进行），每次灌水定额为150 m3/hm2。

试验水源由河南农业大学科教园区水井提供，施肥灌溉首部系统采用移动式施肥灌溉一体机（由汽油机水泵、过滤器、施肥桶、空气阀等部件构成），管网系统由主管道（PE材质，直径63 mm）连接贴片式滴管带（PE材质，直径16 mm，滴头间距30 cm，滴头流量2.5～3 L/h）组成。

1.3 样品采集和测定项目

1.3.1 烟株样品采集

田间试验选取烟株移栽后20 d、30 d、40 d、50 d、60 d、70 d、80 d、90 d、100 d、110 d、120 d 的烟株，每个处理分别挖取长势一致的烟株3株，在105℃下杀青20 min，65℃烘干至恒重，称重后粉碎，计算3株烟干重的平均值，用于分析氮素和干物质的积累。

盆栽实验选定各处理具有代表性的烟株，分别在移栽后20 d、40 d、60 d、80 d、100 d时取第13、14叶位叶片，样品遮光并用干冰保存运送到实验室进行RNA 提取和氮素代谢相关酶活性的测定。另选取具有代表性烟株若干，分别在其还苗期、伸根期、旺长期和成熟期，完整挖取其根部，每个处理3株，用清水轻轻冲洗去根上的土壤，再装入60目尼龙网袋中用清水洗净，用吸水纸吸取根系表面水分，分别测定根体积，计算其平均值，并留取少量用于测定根系活力。

1.3.2 测定项目

1.3.2.1 烟株总氮的测定及氮素效益的计算

总氮测定采用半微量凯氏定氮法。氮肥表观利用率用差值法[12]计算，氮肥表观利用率=（施氮区吸氮量-空白对照吸氮量）/施氮量×100%；土壤氮素依存率=空白对照吸氮量/施氮区吸氮量×100%；氮肥偏生产力（kg·kg-1）=施氮区产量/施氮量。

1.3.2.2 烟株根系活力和根体积的测定

根体积的测定采用排水法；根系活力的测定采用TTC还原法[13]。

1.3.2.3 叶片总RNA的提取

使用RNAiso Reagent 试剂盒（TaKaRa公司）提取参试材料叶片的总RNA。将提取的RNA溶于适量的DEPC水中，采用紫外分光光度计分别测定OD260 nm和OD280 nm并计算二者比值，以判断提取RNA的纯度和浓度；然后进行2%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

1.3.2.4 荧光定量PCR

以 烟 草Actin基 因（Genebank Accession No. AB158612）为内参，引物序列为Actin-F:5’-GCTGTTTTTCCTAGTATTGTTGGTC-3’，Actin-R: 5’-AATACCTGTTGTACGGCCACTG-3’；编 码 G S酶 的 G S基 因（G e n e b a n k Accession No. X95933.1） 引 物 为F:5`-C A G C A AT C T C C G C A AT C C-3`，R:5`-CGAGCCTATCCCGACAAA-3`； 编 码NR酶的NITR基 因（GenBank Accession No.X14058.1）引 物 为 F: 5`-ATCCAGTTATCAGCGGTA-3`，R:5`-GGCAGTTCAGTCACATAGA-3`。

荧光定量 PCR 反应体系为 20 µL：10 µLSYBR Green qPCR Mix，0.4 µL Forward Primer（10 μmol/L），0.4 µL Reverse Primer（10 μmol/L），0.4 μLROX，1 μLcDNA，7.8 μL水；PCR扩增程序为：95℃预变性10 min；95℃变性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸45 s，共循环40次，分离后4℃保存。

1.3.2.5 氮素代谢相关酶活性测定

按照O’Neal等[14]的方法测定粗酶提取液中GS的活性； 采用活体法[15]测定NR活性。

1.3.3 经济效益计算

按处理统计其产量，根据烤烟42级国标（GB2635-92）[16]对烤后烟叶分级，确定烤烟的产值、均价和上等烟比例。

1.4 数据处理

所有试验数据采用Excel 2013进行整理，采用SPSS 22.0软件进行统计分析和曲线拟合，采用Duncan新复极差法进行多重比较，显著性分析水平为0.05，采用Sigmaplot 12.5软件进行图表绘制。采用Prizm 4统计分析软件进行荧光定量PCR数据统计分析，使用2T-△△C的方法对基因的相对表达量进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对烟株干物质积累特性的影响

由图1A可以看出，烟株干物质积累规律呈“S”型曲线变化，处理间变化趋势一致，DF处理的烟株干物质积累总量要显著高于FP和CK处理。在移栽30 d之前，处理间干物质积累量差异不显著，从移栽30～40 d，CK处理与其他处理表现出显著差异，移栽40 d后，处理间表现显著差异，且始终表现为DF＞FP＞CK。这说明水肥一体化处理可以显著增加大田烟株干物质积累量。

根据不同处理烟株干物质积累变化规律曲线（图1A），利用方程y=exp(a+b/x)对曲线进行拟合，其中，y 为干物质积累量（ g·株-1），x为移栽后天数（d），a、b为待定参数。回归方程经F测验得到的P值均小于0.0001，达极显著水平，即拟合方程具有统计学意义，进一步求时间的二阶导数可计算出各处理最大积累速率及其对应时间，如表1所示。

由各处理烟株干物质积累速率变化规律（图1B）可以看出，各处理间变化趋势一致，不同时期的干物质积累速率均表现为DF＞FP＞CK。从表1可以看出，DF处理最大积累速率最高，为9.19 g·株-1·d-1，分别是FP和CK处理的1.64倍和3.18倍，且DF处理最大积累速率出现最早，为42.43 d，分别较FP和CK处理提前了5.46 d和9.02 d。这说明水肥一体化处理不仅可以提高烟株最大干物质积累速率，还可以促使烟株的最大干物质积累时间提前。

图1 不同处理烟株干物质积累量和积累速率的变化规律（2年田间试验均值）Fig.1 The change regulation of dry matter accumulation and

2.2 不同处理对烟株氮素吸收特性的影响

各处理烟株氮素积累量的变化规律（图2A）与干物质积累量的变化规律一致，均呈现出“S”型变化趋势。从总体来看，处理间氮素积累总量表现为DF>FP>CK，差异显著。从不同时期的氮素积累量（图2B）来看，烟株移栽20～30 d氮素积累量较少，此期间内各处理氮素积累量分别为总氮素积累量 的 3.24%、4.21%、12.77%； 移 栽 30～40 d，CK和FP处理氮素积累量发生明显变化，分别占总氮素积累量的6.99%、15.86%，DF处理此期间内积累量继续增加，但增加幅度较小，积累量占总氮素积累量的14.53%；移栽40～70 d烟株进入旺长期，各处理氮素开始大量积累，积累量分别占总氮素积累量的60.28%、46.56%、55.68%；移栽70 d后氮素积累速率逐渐下降，直到90 d后氮素积累趋近于停止，此期间内各处理氮素积累量分别占总氮素积累量的14.86%、19.04%、4.79%。这说明水肥一体化处理通过精准施肥和后期氮素调亏能促使烟株前期大量高效的吸收氮素，减少生育后期氮素摄入，促使烟叶成熟落黄。

图2 不同处理烟株氮素积累变化规律和不同生育期积累量的比较（2年田间试验均值）Fig.2 Comparison of the change regulation of N accumulation and variation of different growth stages in different treatments (Mean of two years for field experiment)

2.3 不同处理对烟株肥料氮素利用率的影响

从表2可以看出，CK处理由于氮素供应不足，烟株生长发育不良，其产量、产值、均价和上等烟比例均为各处理表现最差，DF处理表现最好，其产量为3287.25 kg·hm-2，较FP处理增产了13.23%；产值为76428.6元·hm-2，较FP处理增加了29.56%；均价和上等烟比例分别为23.09元和32.20%，较FP处理分别提高了11.65%和30.36%。可见，采用水肥一体化技术能明显增加烤后烟叶的产值，而烟叶品质提高对产值增加的贡献要大于产量提高。

烟叶的产量和质量受氮素供应情况的影响较明显。从表3可以看出，各处理烟株全生育期总吸氮量存在显著差异，表现为DF>FP>CK。DF处理较FP处理的总吸氮量增加了14.98%，氮肥表观利用率提高了93.21%，较高的氮素吸收量和表观利用率也为烟株产量和质量的提升打下了基础。土壤氮素依存率和氮素偏生产力可以综合反映烟株对施入氮素的利用情况，与烟株氮肥表观利用率有直接的关系。由于DF处理烟株氮肥表观利用率较高，其土壤氮素依存率较FP处理降低了15.01%，氮肥偏生产力提高了15.24%。

表2 不同处理经济效益的比较（2年田间试验均值）Tab.2 Comparison of economic benefits in different treatments (Mean of two years for field experiment)

表3 不同处理氮素效益的比较（2年田间试验均值）Tab.3 Comparison of nitrogen benefit in different treatments (Mean of two years for field experiment)

2.4 不同处理对烟株根系生长发育的影响

2017年对各处理不同生育期烟株根系活力的测定结果（图3A）表明，各处理变化趋势一致，均为随着生育期的变化，根系活力先增高后降低，且在旺长期达到最大，DF处理的烟株在旺长期的根系活力达到 700.01 µg·g-1·h-1，分别是 FP 处理和 CK 处理的1.92倍和1.18倍。就3个处理在不同生育期根系活力的差异水平而言，还苗期差异不明显，伸根期和旺长期差异达到显著水平，成熟期DF处理和FP处理差异不显著，但显著高于CK处理；总体来说，3个处理烟株的根系活力表现为DF>FP>CK。

对比各处理烟株成熟期的根体积（图3B）可以看出，各处理不同生育期烟株根体积存在着明显的差异。还苗期3个处理差异不显著，伸根期DF处理要显著高于CK处理和FP处理，而CK处理和FP处理差异不显著，旺长期3个处理烟株根体积明显增加，分别是前一时期的4.76倍、6.32倍、5.22倍，DF处理和FP处理差异不显著，但显著高于CK处理，进入成熟期各处理烟株根体积进一步增加，DF处理和FP处理增加幅度较大，分别较前一时期提高了59.22%和62.13%，CK处理增加幅度较小，较前一时期提高了27.27%。这说明水肥一体化处理能促进烟株根系生长发育，提高根系活力。

2.5 不同处理对烤烟氮代谢关键酶活性及其相关基因相对表达量的影响

由图4A和图4B可以看出，GS活性和GS基因相对表达量随生育时期变化的规律不一致，但是2个处理之间差异不明显。NR是一种诱导酶，同时作为NO3-同化过程中第一个关键酶，对作物氮素代谢有着重要的影响。NR同时也是氮代谢的第一个限速酶，受施肥等栽培措施和光照等环境条件的影响较大。由图4C可以看出，2个处理NR活性变化规律相似，均表现为随着生育期的推迟逐渐下降。DF处理的NR活性在移栽后20 d和40 d时均明显高于FP处理，分别是其1.26倍和1.31倍。在移栽后60 d时，2个处理的NR活性均出现不同程度的下降，DF处理的NR活性较40 d时下降了28.68%，FP处理的NR活性则下降了21.17%，此时DF处理的NR活性依然高于FP处理。在移栽后80 d，DF处理的NR活性出现了较大幅度的下降，较60 d时下降了60.84%，而FP处理的NR活性仅下降了24.79%，此后FP处理的NR活性均要高于DF处理。比较2个处理编码硝酸还原酶的NITR基因相对表达量（图4D）可以看出，在移栽20 d和40 d时DF处理的NITR基因的相对表达量均要明显高于FP处理，分别是其1.20倍和1.38倍。与NR活性变化规律不同的是，DF处理NITR基因相对表达量的大幅下降出现在移栽后60 d，较40 d时下降了54.76%，而同期FP处理NITR基因仅下降了24.43%，在移栽60 d后高于DF处理。

图4 不同时期烤烟氮代谢关键酶的活性及其相关基因的相对表达量（盆栽实验）Fig.4 The enzyme activity and relative expression of gene related to nitrogen metabolism at different stages（Pot experiment）

3 讨论

3.1 对烤烟干物质积累、氮素吸收以及肥料利用率的影响

关于烟草干物质积累和氮素吸收规律的研究已有大量报道，主要集中在施氮量[17]、氮素形态[18]、肥料类型[19]等方面，对于水肥一体化对烟株干物质积累和氮素吸收规律的影响却鲜有报道。本研究结果表明，水肥一体化处理烟株的干物质积累和氮素吸收规律与常规栽培处理相同，变化规律的曲线拟合结果均呈“S”型，这与李青军等[20]的研究结果相一致。但在积累总量和积累速率方面却表现出显著差异，水肥一体化处理干物质积累总量和氮素吸收总量显著高于常规栽培处理，是其1.42倍和1.41倍，段锦波等[21]的研究也有相类似的结果，这与氮素利用率的提高有关。本试验结果表明水肥一体化处理较常规栽培处理的氮肥表观利用率提高了93.21%，氮肥偏生产力提高了15.24%，土壤氮素依存率下降了15.01%。已有研究表明，氮肥随水滴施可有效地促进植物对氮肥的吸收，因此氮素利用率的提高不仅在于肥料本身，更重要的还在于与水分的互作[22]，水肥一体化条件下实现了水肥的同步管理，通过滴灌管道按照烟株不同生育期的需水需肥规律精准施肥，一方面适宜的水分供应可以促进肥料转化及吸收，提高肥料利用率，而适宜的施肥也可以调节水分利用过程，提高水分利用率。同时，水肥一体化条件下施肥和灌水均遵循“少量多次”的原则，既能满足烟株生长发育的需要，又避免了因肥料施用过量或者灌水过量而造成的挥发或淋溶等损失[23]，进一步提高了氮素的利用率。

3.2 对烤烟根系生长发育的影响

根系是烟株重要的营养器官，与地上部分的生长关系密切，其活力的高低和体积的大小直接影响着地上部分的成长发育及形态建成，在一定程度上反映了作物吸收水分和矿质养分的能力，直接影响着根系的生长发育状况，对植物的生长起着决定性作用[24]。关于土壤水肥供应状况对根系生长发育的影响，前人在水稻[25]、大豆[26]、玉米[27]、棉花[28]等作物上已做了大量的研究，水肥一体化滴灌施肥较传统漫灌或沟灌施肥能显著改善根际土壤的水肥供应状况，促进植物根系发育和养分吸收，对作物增产有着极其重要的作用，这与本研究的结果相一致。本研究表明，DF处理烟株的根系活力在旺长期达到 700.01µg·g-1·h-1，分别是FP处理和CK处理的1.18倍和1.92倍，DF处理烟株的根体积在成熟期达到330.2 cm3，分别是FP处理和CK处理的1.31倍和2.66倍。这可能是因为采用滴灌施肥使根际土壤的水分和养分状况始终适于烟株生长的条件，有利于烟株根系活力增强，尤其是在生育中后期依然保持较高水平，同时，滴灌施肥可以使土壤通气条件改善[29]，良好的水肥供应条件可以刺激侧根的发育和根毛的形成，使烟株根体积增加，对烟株根系形态的形成有着积极的作用，而常规栽培处理由于水分供应不够及时，烟株经常处于水分供应不充足的状态下，影响根系的生长发育[30]，且在水分供应不足的情况下，土壤中养分浓度增加，土壤水势降低，进一步加剧了水分胁迫，从而使根系从土壤中吸收水分和养分更加困难。

3.3 对烤烟氮代谢关键酶活性及其相关基因相对表达量的影响

大量研究表明， GS和NR是烤烟氮素代谢的关键酶，其活性的强弱直接影响到烤烟对氮素的吸收和利用，进而影响烟株的干物质积累[31]。GS催化产生谷氨酰胺，常与谷氨酸合酶协同作用，组成GS/GOGAT循环，这是高等植物NH4+同化的主要途径[32]。植物中所需要的氮素主要来自土壤中硝态氮和铵态氮，但是植物吸收硝态氮后，必须经过一系列还原变成NH4+后才能用于形成氨基酸和蛋白质，而第一步还原反应（NO3--NO2-）就需要NR催化，因此，NR是植物氮同化代谢中的第一个限速酶和调节酶，常被用来表示植物氮代谢的强度[33]。已有研究表明，NR酶活性受水肥供应条件影响较大，韩锦峰等[34]指出干旱条件下NR活性显著下降，适宜的水分供应可以显著提高其活性。耿素祥等[35]比较了烤烟在不同施氮量条件下的NR活性，认为NR活性与施氮量呈正相关，在一定范围内随着施氮量的增加而增加。本研究结果也表明，在水肥一体化条件下合理供应烟株生长发育所需的水分和养分，能显著提升NR活性和NITR基因的相对表达量，但对GS活性和GS基因相对表达量影响不大。随着NR活性的提高，土壤中原有的以及施入肥料中所含的硝酸盐被还原变成NH4+，进而参与到氨基酸和蛋白质合成中，提升

了烟株对土壤氮素的吸收利用能力，进而提高了肥料的利用率。本研究结果还发现，采用水肥一体化技术的烟株NR活性在移栽后40 d前后显著高于常规栽培处理，而在移栽60 d前后出现了大幅下降，这说明水肥一体化处理烟株在前期大量同化硝酸盐，增强了烟株的氮代谢过程，田间长势较旺，这也解释了水肥一体化处理最大干物质积累速率和氮素吸收速率较常规栽培处理明显提前的现象，而在移栽60 d后，烟株进入成熟期，水肥一体化处理不再施入氮素，土壤中残留氮素有限，NR活性开始急剧下降，烟株对硝酸盐的同化能力减弱，从而促使烟株开始成熟，并且逐渐落黄。关于水肥一体化技术调控NR活性及NITR基因表达的机理，相关研究尚未涉及，仍需进一步研究。

4 结论

水肥一体化实现了“以水促肥、以肥调水、水肥同步”，能够显著增强烟株前期的NR活性，促进烟株对氮素的吸收，提高了肥料的利用率。连续2年的田间试验和1年盆栽试验结果表明，在氮磷钾养分投入相同的情况下，水肥一体化处理烟株根系生长发育较好，根体积较大，根系活力明显增强，烟株大田生长发育优于常规栽培处理，烟叶产质量明显提升，氮肥表观利用率提高了93.21%，干物质和氮素积累量分别是常规栽培处理的1.42倍和1.41倍，且水肥一体化处理最大干物质积累速率和最大氮素积累速率均较常规栽培处理显著提高且提前出现，而在烟株进入成熟期后氮素调亏，烟株NR活性迅速下降，氮素摄入量减少，从而促进烟株成熟落黄，有利于烤后烟叶品质的提升。总之，通过滴灌根据烟株的需水需肥规律进行精准施肥，调控烟株的干物质积累和氮素吸收，对氮素利用率和产质量的提高能产生积极的影响。

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