5-羟色胺2C受体基因多态性与特发性癫痫关联研究

徐珑洋， 伍雪英， 林 旭， 何进宇， 张 林， 王志敏， 王英明， 徐亚欧

癫痫又名羊癫疯，是大脑神经元异常放电、导致短暂大脑功能异常的一种慢性疾病，据估算全球65亿人口中有癫痫患者5500万人，据流行病学调查，一般人群的年患病率为5‰～7‰[1]，而其发病机制十分复杂，且研究较少，目前临床抗癫痫类药物的治疗效果也不佳[2]。从20世纪初期，人们就通过遗传学研究观察癫痫的家族性发病倾向，并发现某些特定基因对癫痫发病起作用。

目前，在人类中枢神经系统中5-HTR受体一共发现了7种，14个亚型，通过不同的交互能力和G蛋白激活磷脂酶C和D信号级联反应，而5-HTR2C是唯一由RNA修饰调节的G蛋白偶联受体，调节血清素在中枢神经系统中的传递，具有降低细胞兴奋的功能[3]。5-HTR2C定位于X染色体q24区，含3个内含子，编码458个氨基酸，主要作用于中枢系统，包括脉络丛、嗅核、梨状核、带状核、边缘系统的伏隔核、海马杏仁核和基底神经节的尾状核和黑质及外周神经[3]，目前5-HTR2C作为抗癫痫药物新的靶点已进入临床前及临床评价阶段。本研究采用PCR-SSCP,结合测序方法检测癫痫患者与正常人5-HTR2C基因单核苷酸多态性(SNP)位点并利用统计学方法分析其多态性与特发性癫痫的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 实验组标本均来自成都三六三医院癫痫专科就诊并确诊为特发性癫痫患者220例，癫痫诊断根据发作史，目击者对发作过程提供可靠的详细描述，辅以脑电图痫性放电、脑血管造影、核素脑扫描、CT、MRI等检查证据共同确诊。其中男性107例，年龄2～78岁，占患者总人数48.63%；女性113例，年龄5～79岁，占患者总人数51.37%。对照组标本血液均来自成都三六三医院健康体检部人群一共200例，其中对照组年龄、性别、所属地区构成均与实验组匹配。以上所有病例均征得患者及家属同意后签署家属知情同意书，采取静脉采血的方法提取血液。

1.2 方 法

1.2.1 血液总DNA提取 采取静脉采血的方法提取研究对象血液，血液标本采回后放入含抗凝剂的10 ml离心管，至于冰箱-20 ℃中保存。DNA提取按照天根生化科技(北京)公司的血液DNA提取试剂盒操作进行，取400 μl血液提取得到160 μl溶液，至于-20 ℃保存，防止DNA降解。

1.2.2 PCR引物设计合成 根据NCBI公布的5-HTR2C基因序列(Gene ID:3358)，利用Primer Premier 6.0设计引物并将其与NCBI数据库Primer-BLAST进行引物在线比对，设计引物送生工生物有限公司合成(纯度为PAGE级)。rs113961355位点：上游引物5’-GGATGATATGATGAACCTAGCC-3’，下游引物5’-TTACAGGAATGAATGCACCG-3’，115 bp；rs114141491位点：上游引物5’-ACCCTAACCAAGACCAGAACG-3’，下游引物5’-GGCACCACATGATCAGAAACA，141 bp；rs113817908位点：上游引物5’-CTTGTCTCCCCATCCTTTCCCT-3’，下游引物5’-ACCTCTTGCTGCCTTGACCTTG-3’，259 bp。

1.2.3 PCR扩增及检测 按照Takara公司Long Taq PCR Master Mix混合酶使用说明配25 μl的反应体系： Long Taq PCR Master Mix 12.5 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，DNA模板1 μl，ddH2O 9.5 μl。PCR反应条件：预变性94 ℃ 5 min，变性94 ℃ 30 s，退火54 ℃(rs113961355)/58 ℃(rs114141491)/64 ℃(rs113817908)30 s，延伸72 ℃ 30 s，延长72 ℃ 10 min，共35个循环。

获得的PCR产物经由1～2%琼脂糖凝胶水平电泳检测，根据克隆基因大小确定电泳条带为目的条带，且条带清晰、单一无杂带干扰。

1.2.4 SNP位点检测及测序 PCR产物变性后(取1 μl PCR产物加入9 μl LIS-SSCP变性缓冲液，混匀， 98 ℃变性10 min，之后迅速拿出PCR管置于冰上急速冷却5 min)加样于12%聚丙烯酰胺凝胶上，200 V电泳90 min。银染后出现特异性条带，根据条带分析结果，挑取不同带型产物送生工生物有限公司测序。

1.2.5 统计学分析 根据Hardy-Weinberg平衡检测及χ2检验检测原理对5-HTR2C受体基因rs113961355、rs114141491、rs113817908多态位点基因型频率与等位基因频率在病例组及对照组中是否存在显著性差异，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 测序结果分析 以5-HTR2C受体基因rs113961355位点、rs114141491位点、rs113817908位点设计的引物2%琼脂糖凝胶电泳检测，经紫外光照射均可见一条明亮清晰的荧光条带大小分别为约115 bp、141 bp、259 bp与预期结果相符。

分别对5-HTR2C受体基因三位点的PCR产物进行PCR-SSCP检测，发现只有rs113817908位点处出现3种条带，而其余两点位点未发现变异条带。结合基因测序显示rs113817908位点为A/C突变，与预期结果相符，分别定义为AA、AC、CC 3种类型(见图1)。

2.2 Hardy-Weinberg平衡检验分析 采用Hardy-Weinberg平衡检验对癫痫病例组与正常对照组rs113817908位点基因多态性进行适应性检验，χ2值分别为189.68、185.40，P值小于0.005，差异极显著,说明5-HTR2C受体基因多态性位点的基因型频率和基因频率在病例组及正常对照组均不处于Hardy-Weinberg平衡状态(见表1)。该结果可能是由两种纯合子个体受某种因素影响，存在潜在作用的选择现象，从而导致无论病例组还是正常对照组的基因及基因型频率差异极显著。

2.3 基因频率及基因型频率独立性检验分析 采用独立性检验，研究特发性癫痫与rs113817908位点突变的关联性。在病例组和正常对照组中等位基因A出现的频率分别为89.32%、84%；等位基因C出现的频率分别为10.68%、16%，C等位基因频率在正常组中明显高于病例组。在病例组和正常对照组中AA型基因出现的频率分别为88.6%、83.5%；在病例组和正常对照组中CC型基因出现的频率分别为10%、15.5%；在病例组和正常对照组中AC型基因出现的频率分别为1.4%、1%。利用独立性检验计算出χ2为5.16，P值小于0.025，说明H3位点基因多态性在病例组和对照组间差异显著，该位点碱基突变与特发性癫痫有机器显著的相关性(见表2)。

2.4 半盒型基因型频率分析 5-HTR2C受体基因定位于Xq24区，癫痫组及对照组基因型分布χ2检验表明，癫痫组H3位点男性患者携带C半盒子与女性患者携带C+(CC与CA)基因型的比率显著低于正常组(男性：χ2=11.5693703，P<0.05；女性χ2=4.109905348，P<0.05)(见表3)。

表1 5-HTR2C受体基因rs113817908位点Hardy-Weinberg平衡检验

表2 5-HTR2C受体基因rs113817908位点的等位基因频率和基因型频率

P<0.05表示差异显著

表3 5-HTR2C受体基因rs113817908位点半盒子基因型频率比较

A～C分别为CC、AA、CA基因型

图1 5-HTR2C受体基因rs113817908位点测序图谱

3 讨 论

遗传学研究观察癫痫的家族性发病倾向，多数人认为癫痫病具有遗传倾向，但具体遗传模式及治病基因尚未明确。目前研究表明，癫痫的发病是由多基因、多位点共同作用的结果。大量研究表明，5-HT及其受体5-HTR1A、5-HTR2C、5-HTR 3、5-HTR7等对癫痫的发病都具有重要作用[4]，对其神经兴奋起了抑制作用。研究发现， 5-HTR2C受体基因缺失的小鼠呈现出偶发性癫痫综合征,有时甚至导致死亡[3]，相比于对照组野生型小鼠，缺失5-HTR2C受体的小鼠发作更为敏感[5]，5-HTR2C受体基因被破坏的小鼠也可表现出癫痫的症状，且较正常的小鼠有较低的癫痫域值[2]。对大鼠用M-CPP(5-HTR2C受体激动剂)可以抑制肌阵挛作用效应可持续1 h，并在时间和数量上出现显著的剂量依赖性[6]。曾有研究表明，M-CPP可加重强迫症的发病概率，对此我们可将癫痫与强迫症的发病做相关性研究[7，8]。国内外目前关于5-HTR2C受体抑制痫性发作的机制研究尚少,有人认为5-HTR2C受体在杏仁核点燃过程中起到了约束的作用，还有研究证明它能抑制细胞内外核质网络的点燃[9]。

本研究所设计的rs113817908位点分布于5-HTR2C受体基因5’侧翼，与基因转录有关。所研究的5-HTR2C 基因H3位点出现3种条带类型，基因测序结果显示第89位碱基突变，其基因型分布为AA、AC、CC,说明此位点位A/C突变。平衡检验结果表明无论癫痫组还是正常组中，基因及基因型频率差异极显著(P<0.005)，说明5-HTR2C基因rs113817908多态性位点基因型频率、基因频率在两组中都不处于Hardy-Weinberg平衡状态。从基因型分布来看纯合子占绝对优势，该结果说明杂合子受某种因素影响，导致杂合子个体不利于其选择，从而导致杂合子显著低于两种纯合子。另一可能的原因是，本研究所抽取的样本在其表型上与杂合基因型有某种关联，从而导致所选样本出现此种现象[10]，这有待于进一步研究。也有可能是因为本研究所抽取的样本多集中于中国西南地区，受地域、人种的遗传背景等因素影响。虽然中国西南地区人群相对均一性较好，遗传背景基本相同，但也应在不同地域的人群中进行类似研究，以消除地域偏倚，同时也应在家族连锁不平衡研究中寻找更多的证据[11]。

利用独立性检验得到的χ2值为5.16，P值<0.025，表明rs113817908位点在特发性癫痫病例组和正常对照组中差异显著，男性患者携带C半合子与女性患者携带C+(CC与AC)基因型的比率及C等位基因的频率均明显高于对照组，亦验证了这一假说。说明此位点与特发性癫痫有相关性，其位点突变可能与基因转录有关。

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