高效液相色谱法同时测定食品中11种添加剂

周 原 刘 坤 代 钰 何 艳 周晓婷

(武汉食品化妆品检验所，湖北 武汉 430000)

现代食品产业中，食品添加剂发挥着巨大的作用。食品添加剂能够改善食品品质和延长保质期。食品添加剂已经成为食品中不可缺少的物质，各国都致力于开发新产品及新技术。食品添加剂在使用过程中除应保证其原有作用外 ，更应保证其安全性。但近年来，假酒中毒致死案件、“糖精枣”、“瘦肉精”、“染色馒头”、“红心鸭蛋”、“三聚氰胺奶粉”等重大食品安全事故频发，一些食品加工企业缺乏社会责任感，违规添加食品添加剂甚至使用有毒原料，给我国的食品行业带来了沉重的打击，因此需要严格监控食品添加剂的使用。

高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chrom atography ,HPLC)是20世纪60年代末，在经典液相和气相色谱基础上发展起来的新型分离分析技术。高效液相色谱法具有操作简便、检测灵敏度好、对样品适用范围广、可供选择的流动相种类多、分析速度快、能分析高沸点有机物和热稳定性差的化合物等特点。至今，高效液相色谱法已经在食品工业、制药工业、石油化工等领域获得广泛应用。在现行的国标中，对食品添加剂的检测，多是针对一种或少数几种添加剂，而一种食品中往往同时使用多种食品添加剂，如果按照现行的标准进行检测，必须对样品进行多次处理，分别检测不同的添加剂，费时费力。目前报到的文献中，大多数是针对饮料等简单基质的食品中添加剂进行研究，对糕点、蜜饯等复杂基质食品中添加剂的研究较少，且已报道的方法多直接用水提取，对食品中低含量的色素提取效果较差。本研究用碱性的有机溶剂提取食品中的添加剂，采用反相高效液相色谱法，同时测定食品中11种常见的添加剂。实验证明，该方法具有提取效果好、前处理简单、快速、准确等优点。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UltiMate 3000高效液相色谱仪：配DAD-3000 光电二极管阵列检测器及ChromeleonTM色谱作站，美国戴安公司；超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；超纯水系统，美国Millipore公司；电子分析天平，日本岛津公司。

甲醇，Merck 公司，色谱纯；乙酸铵，北京中西泰安技术服务有限公司，优级纯；0.5mg/mL安赛蜜、1.0mg/mL苯甲酸、糖精钠、山梨酸、柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、诱惑红、亮蓝、咖啡因标准储备液，国家标准物质中心。

1.2 混合标准储备液的配制

分别精密吸取标准储备液各5mL，于100mL的容量瓶中，用Millipore水稀释至刻度，摇匀，即配成安赛蜜的浓度为25.0mg/L，其余10种食品添加剂的浓度均为50.0mg/L的混合标准储备液。

1.3 供试品溶液的制备

将样品剪碎或放入捣碎机捣碎，精密称取5.0g于50mL的具塞比色管中，加35mL 1%的氨水-乙醇溶液，超声提取30min，用水定容至50mL，摇匀，3000r/min离心15min，取上清液，调pH值至中性，用微孔滤膜过滤后备用。

1.4 色谱条件

色谱柱：DIONEX Acclaim 120 C18(4.6×250mm,5μm)；流动相为甲醇和20mmol/L乙酸铵，梯度洗脱程序见表1，流速为1mL/min，柱温为30℃，进样量为5μL，采用保留时间和光谱图定性，峰面积外标法定量。

表1 梯度洗脱程序表

2 结果与讨论

2.1 流动相及pH的选择

本实验考察了乙腈-20mmol/L乙酸铵和甲醇-20mmol/L乙酸铵两种流动相系统，经过不同的梯度洗脱程序，11种添加剂均能实现基线的分离。但乙腈的毒性较大，故本实验采用甲醇-20 mmol/L乙酸铵作为流动相。

用冰乙酸将20mmol/L乙酸铵缓冲溶液的pH值分别调至3.0、4.0、5.0、6.0和7.0，然后考察不同pH值的流动相分别对11种食品添加剂分离的影响。实验结果表明，pH值的改变对色素的分离影响较小，但对苯甲酸、山梨酸和糖精钠的分离有较大的影响。当pH为3.0、4.0和5.0时，个别色谱峰严重拖尾，11种添加剂不能被完全分开；当pH为6.0和7.0时，峰形较好，所有添加剂均能实现基线的分离。由于20mmol/L乙酸铵缓冲溶液的原始pH值在6.0～7.0之间，故本实验不对流动相的pH值进行调节。

2.2 检测波长的选择

尽管各组分均有紫外吸收，但最大吸收波长各不相同。二极管阵列检测器的特点是可以同时检测和处理多个波长的色谱图，本实验对比了210、230、254、420、520、628nm六种检测波长下各组分的响应值。通过对比发现：除亮蓝外，在230nm处各组分的灵敏度相对较高。因此，本实验在230nm处对安赛蜜、苯甲酸、糖精钠、山梨酸、柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红、诱惑红和咖啡因进行同时检测，色谱图见图1a；在628nm处对亮蓝进行检测，色谱图见图1b。结果表明，各组分间无干扰，一次进样可以同时测定11种食品添加剂。

图1 11种食品添加剂混合标准液的色谱图

(1.安赛蜜，2.柠檬黄，3.苯甲酸，4.糖精钠，5.山梨酸，6.苋菜红，7.胭脂红，8.日落黄，9.咖啡因，10.诱惑红，11.亮蓝)

2.3 线性关系和最小检出量的考察

将11种食品添加剂分别配制成一系列不同浓度的标准溶液，按照上述色谱条件进行测定，以浓度为横坐标，测得的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，以样品峰高为基线噪音峰高的3倍为准计算最小检出量。结果表明，11种食品添加剂的相关系数R2均大于0.999，线性范围为0.5～800mg/L，最低检出限在0.1～0.5mg/L之间。

2.4 实际样品的测定

按照1.3所述处理方法处理样品，在优化的色谱条件下，对话梅及青豆中的食品添加剂进行测定，每个样品平行测定三次，得到的色谱图如图2、3所示。表2对比了同一个样品中，用水直接提取和用碱性有机溶剂提取的方法所测得的结果。结果表明，该方法对食品中低含量的色素的提取效果较好，一次进样可以同时检测食品中的11种添加剂。

图2 话梅色谱图(1.苯甲酸,2.糖精钠,3.山梨酸)

图3 青豆色谱图 (a.亮蓝,b.柠檬黄)

样品柠檬黄苯甲酸糖精钠山梨酸亮蓝1nd0.1550.7500.082nd2nd0.1530.7420.079nd30.026ndndnd0.00640.012ndndndnd

注：1：话梅(用碱性有机溶剂提取)，2：话梅(用水提取)，3：青豆(用碱性有机溶剂提取)，4：青豆(用水提取)，nd表示未检出。

2.5 回收率实验

采用碱性有机溶剂提取的方法对话梅在二个不同的添加水平进行加标回收率实验，其分析结果见表3。结果表明该方法的加标回收率为93.5%～104.0%。

表3 回收率的测定结果

2.6 精密度实验

本实验对加标0.2g/kg的青豆样品平行测定6次，根据峰面积外标法对其定量，计算安赛蜜、柠檬黄、苯甲酸、糖精钠、山梨酸、苋菜红、胭脂红、日落黄、咖啡因、诱惑红和亮蓝的RSD分别为0.467%、0.685%、0.974%、0.519%、0.436%、0.808%、0.208%、0.451%、0.665%、0.814%和0.627%，结果表明该方法的重现性较好。

3 结论

该方法前处理简单，采用DAD检测器可以在不同波长下查看不同的添加剂的出峰情况，避免了保留时间接近的峰之间的干扰，一次进样可以测定11种常见的添加剂，并能检测出食品中含量较低的添加剂，具有快速、准确、提取效果好、毒性小、精密度和准确度较高等优点，可以用于多种常规食品中的快速检测。

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