淹涝处理下樱桃总RNA提取方法的建立与优化

2018-05-05生利霞孟祥毅冯立国

上海农业学报 2018年2期

生利霞,孟祥毅,王猛,王倩,冯立国

（扬州大学园艺与植物保护学院，扬州 225009）

樱桃（Prunus serrulata）为蔷薇科樱属落叶果树，味美形娇，营养丰富，在我国有着悠久的种植历史。樱桃品种繁多，从热带到温带都有种植，堪称世界上栽培分布最广的水果之一。果实不仅可鲜食，还是食品、药品工业的重要原料。但樱桃植株根系浅，对环境变化反应敏感。随着现代分子生物学技术的兴起和发展，樱桃抗涝、热、盐等重要抗胁迫的基因工程改良已经开展［1］，而制备大量质量好、纯度高的RNA是基因克隆、表达及转基因研究的前提和重要环节。

樱桃叶片与根茎组织富含多糖、多酚及色素等次生代谢物质，总RNA提取受这些成分的干扰较重，尤其进行逆境胁迫处理时，叶片中叶绿素破裂、酶开始降解，根系不断褐化等一系列问题都会严重影响RNA的提取质量［2-3］。目前，虽然各种RNA提取方法被广泛报道，但由于在不同的状态下不同植物及相同植物的不同组织存在很大差异，因此筛选一种适用于淹涝处理后樱桃总RNA提取方法至关重要。本试验以淹涝处理后的‘沂蒙山樱’材料，采用不同方法提取其总RNA，结合质量检测及RT-PCR验证，建立适合淹涝处理后樱桃叶片与根系RNA的提取方法，旨在为今后樱桃抗涝分子生物学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 樱桃淹涝处理

以‘沂蒙山樱’为试材，进行淹水处理。采用盆栽淹水法。挑选苗龄、大小、长势一致的扦插苗，定植于同规格塑料盆中，土壤类型一致（园土∶蛭石=2∶1），每盆1株，总共30盆。8个月后选取大小、长势一致的植株进行淹水处理。试验在长∶宽∶深=4.5∶1.5∶0.7（m）水槽中进行，连续淹涝处理4 d，保持水层高于盆土表面2—3 cm，定时补水以保证水位。

1.1.2 试材取样

在涝胁迫处理第0、1、2、3、4天取样（S0、S1、S2、S3、S4），随机选取 3株，分别取其幼嫩根系和叶片组织，迅速置于液氮中速冻，带回实验室-80℃保存。选择未淹涝处理（S0）和淹涝4 d（S4）的樱桃根系和叶片进行RNA提取方法比较，其余样品用于RT-PCR检测。

1.2 方法

1.2.1 植物总RNA提取试剂盒法

具体操作按照TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit（Cat#9769）总RNA提取试剂盒附带的使用说明进行。

1.2.2 植物CTAB法

CTAB法具体操作按照参照冯立国等［3］方法。

1.2.3 改良植物总RNA提取试剂盒法

在TaKaRa RNA提取试剂盒法的基础上，针对樱桃组织的特点进行了优化，优化后的具体步骤如下：

（1）超低温保存的试材转移至液氮预冷的研钵中研磨，期间不断加入液氮，直至研磨成粉状。称取300 mg粉状叶片于1.5 mL去酶离心管中（根系称取400 mg于2.0 mL去酶离心管中）。

（2）加10μL的β-巯基乙醇和1 000μL PE的混合液反复摇晃离心管直至充分混匀（约30 min），离心（4℃，12 000 r/min，5 min）。

（3）将上清液小心吸取到新的2.0 mL去酶离心管中。加上清液1/10体积的Buffer NB，剧烈摇匀（此时会出现沉淀），离心（4℃，12 000 r/min，5 min）。

（4）将上清液小心吸取于新的2.0 mL去酶离心管中，加等量氯仿∶异戊醇（24∶1），轻轻混匀，离心（4℃，12 000 r/min，10 min）。

（5）将上清液小心吸取于新的2.0 mL去酶离心管中。加入500μL的Buffer RL（使用前加入10μL 50×DTT Solution），使用移液枪吹打混匀。

（6）加1/2体积的无水乙醇（可能会有沉淀出现），用移液枪吹打混匀。

（7）立即吸取600μL混合液于RNA Spin Column中。（如果混合液的体积大于600μL，分批加入，每次加入的体积不大于600μL），离心（4℃，12 000 r/min，1 min），弃滤液。将 RNA Spin Column放回于2 mL Collection Tuble中。

（8）吸取500μL的 Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，离心（4℃，12 000 r/min，30 s），弃滤液。

（9）吸取 600μL的 Buffer RWB沿管壁加入至 RNA Spin Column中，离心（4℃，12 000 r/min，30 s），弃滤液。

（10）DNase I消化（可选择）：利用本试剂盒提取的RNA时可以有效去除植物中绝大部分基因组的DNA，提起RNA一般不含基因组DNA。如后续试验对RNA的纯度要求严格，可以选择在RNA Spin Column膜上进行DNase I消化。

（11）DNase I反应液的配制：取 4μL Recombinant DNase I（RNase free，5 U/μL），5μL 10×DNase I Buffer，41μL RNase Free dH2O于新的1.5 mL RNase Free Tuble中，使用移液枪混合均匀。

（12）加入50μL DNase I反应液于RNA Spin Column膜中央，室温静置15 min（温度不可过高）。

（13）加入 350μL的 Buffer RWB于 RNA Spin Column膜中央，离心（4℃，12 000 r/min，30 s），弃滤液。

（14）重复步骤9。

（15）将RNA Spin Column重新安置于2 mL Collection Tuble上，12 000 r/min离心2 min。

（16）将RNA Spin Column安置于1.5 mL的 RNase Free Collection Tuble（试剂盒提供）上，在 RNA Spin Column膜中央加入10—30μL的RNase Free dH2O室温静置5 min（以样品质量可适度调整），离心（4℃，12 000 r/min，2 min）洗脱 RNA。

（17）若想提高RNA的收量，可重复将洗脱液再加入于RNA Spin Column的膜中央，室温静置5 min，离心（4℃，12 000 r/min，2 min）洗脱 RNA。

1.2.4 RNA质量和浓度检测

取2μL RNA样品加2μL 10×loading Buffer，2μL RNase-free水，点样于1%琼脂糖凝胶上，220 V恒压电泳10 min，在紫外凝胶成像系统中观察RNA条带，并拍照记录。取1μL RNA样品用DEPC水稀释50倍，混匀，核酸蛋白检测仪（BioPhotometer plus，Eppendorf公司，德国）测定 RNA的浓度，记录浓度、OD260/OD280与OD260/OD230数值用于纯度分析，3—4次重复，计算平均值。

1.2.5 RT-PCR

采用PrimeScript RT reagent KitWith gDNA Eraser（宝生物公司，大连）合成cDNA第一链，PCR检测采用20μL反应体系，Actin引物（JN399225）（ActinF：5’-ACTCCTCCCACATTGCTGTTA-3’；ActinR：5’-CTTCAAGAACTTGGGCTCCTT-3’）。扩增程序：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测，Marker均为DL 2000。

2 结果与分析

2.1 不同方法提取的总RNA完整性检查

以未淹涝处理（S0）和淹涝处理4 d（S4）的‘沂蒙山樱’叶片和根系为试材，分别采用TaKaRa RNA提取试剂盒法、改良TaKaRa RNA提取试剂盒法和CTAB法提取其总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测（图1，图2）。结果表明，采用改良TaKaRa RNA提取试剂盒法提取樱桃叶片与根系总RNA的28S rRNA、18S rRNA条带清晰，明亮，且28S rRNA的亮度明显高于18S rRNA，说明该方法提取的总RNA完整性高，可用于后续检验；采用TaKaRa RNA提取试剂盒法和CTAB法提取的樱桃叶片总RNA，28S rRNA、18S rRNA条带模糊比较暗，拖尾严重，条带完整性较差，根系总RNA的检测结果发现一条模糊条带，说明总RNA严重降解，完整性很差，不符合分子生物学试验要求，说明改良TaKaRa RNA提取试剂盒法可以很好地解决因淹涝胁迫对RNA完整性的影响。

图1 不同方法提取的樱桃叶片总RNA的电泳检测Fig.1 Electrophoretic pattern of total RNA extracted from leaves of cherry using differentmethods

图2 不同方法提取的樱桃根系总RNA的电泳检测Fig.2 Electrophoretic pattern of total RNA extracted from roots of cherry using differentmethods

2.2 不同方法提取的总RNA纯度与浓度检测

纯度较好的RNA其OD260/OD280值应介于1.8—2.0，OD260/OD230值应大于2.0。若OD260/OD280值小于1.8，则表明多糖、蛋白和酚类物质较多，若OD260/OD280值大于2.0，则表明RNA有部分降解。OD260/OD230小于2.0，则表明裂解液中有β-巯基乙醇和酚类物质残留［5］。由表1、2可见，采用改良TaKaRa RNA提取试剂盒法提取的樱桃叶片与根系的OD260/OD280值介于1.95—1.99，OD260/OD230值介于2.03—2.13，RNA质量浓度均较高，说明所提取的RNA纯度较好，降解较少，蛋白等杂质的污染较少。而另外两种方法均不符合RNA纯度要求，说明RNA存在降解，杂质较多，质量较差。

表1 不同方法提取的樱桃叶片总RNA浓度和纯度检测Table 1 Concentration and purity of RNA from leaves of cherry using differentmethods

表2 不同方法提取的樱桃根系总RNA浓度和纯度检测Table 2 Concentration and purity of RNA from roots of cherry using differentmethods

2.3 RT-PCR检测

采用改良TaKaRa RNA提取试剂盒法分别提取淹涝处理4 d过程中（S0、S1、S2、S3、S4）‘沂蒙山樱’的根系RNA，并以其为模板进行反转录，将合成的cDNA用樱桃Actin引物（JN 399225）进行PCR扩增。RT-PCR的结果如图3所示，叶片与根系均扩增出约100 bp的cDNA的片段。扩增条带均清晰明亮，能够满足后续分子生物试验对RNA质量的要求。

图3 淹涝处理后樱桃叶片和根系总RNA的RT-PCR检测Fig.3 RT-PCR result of total RNA from leaves and roots of cherry after waterlogging treatment

3 讨论

樱桃本身含有较多的多糖、多酚、蛋白质及次生代谢物等［8］，RNA提取过程中需要去除，同时还要防止逆境胁迫等次生灾害所引起的RNA降解。因此，在淹涝胁迫后依然可以获得纯度高、完整性好的总RNA尤为重要。传统CTAB法具有明显的局限性，其样品的需求量大，操作繁琐，用时间久，对于数目多且稀少的样品并不适合［7］。淹涝处理中，樱桃根系长时间浸泡在水中，导致根系褐化、蛋白质失活、酶降解，甚至腐烂［2］，大大增加了RNA提取的难度，因此，采用CTAB法提取淹涝处理后樱桃根系的RNA，其质量并不理想。

TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit是针对植物 RNA提取试剂盒，具有操作简单、用时短，RNA质量良好等特点，广泛适用于各种植物材料RNA的提取，效果良好。本试验中，采用TaKaRa RNA提取试剂盒法提取樱桃总RNA遇到了一些问题，主要表现为叶片和根系在裂解过程中褐化严重，在过滤膜上有褐色杂质，并导致所得RNA具有颜色。这可能是因为樱桃叶片和根系中多糖和酚类物质较多，在样品裂解过程中叶片酚类物质极容易被氧化成醌类等次生代谢物质，并与蛋白质及RNA结合，使叶片褐化，影响RNA的分离纯化［9］，至于该褐色杂质具体为何化合物，将在后续研究中通过液相色谱-质谱联用技术进行定性定量分析。

本试验在TaKaRa RNA提取试剂盒法的基础上，针对樱桃叶片和根系提取过程中遇到的问题进行了优化。在PE裂解液中加入1/100的β-巯基乙醇，从而有效地解决了褐化问题，这可能是由于β-巯基乙醇为强还原剂，能够抑制细胞色素酶和多酚氧化酶的活性［10］，对樱桃叶片与根系的酚类物质去除效果较好。加之氯仿与异戊醇可以与残留的酚类物质反应，并去除蛋白质，因此可以看出在上清液与氯仿/异戊醇混合液中有一层明显的杂质［11-12］。通过对试剂盒法改良，可逐步解决酚类物质和蛋白质的干扰问题，最终得到较高纯度的RNA。

综上所述，本试验建立的改良RNA提取试剂盒法可在淹涝处理下依然可以获得具有较高完整性和纯度的高质量RNA，是理想的樱桃组织RNA的提取方法，适用于大批量样品的分子生物学试验研究。

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