兽药残留检测中试剂盒的验证方法研究

马惠文

（烟台市动物疫病预防与控制中心，山东 烟台 264003）

兽药残留是指在畜禽等食用动物使用药物后，药物发生蓄积，以药物化学原型成分、分解中间体或杂质等形式，存在于动物的细胞、器官或者组织内部。这些物质对人的身体健康会产生非常严重的伤害或者引起病菌的耐药性。因此，目前世界上许多国家对于动物性食品安全的主要评价手段就是通过兽药残留的检测。但是，在应用试剂盒进行检测过程中，发现有的检测结果和试剂盒标注的各种技术指标存在较大差异，严重影响检测人员对检测结果的判定。因此，在采用试剂盒进行药物残留检测之前对试剂盒各项技术指标进行严格的验证，会大幅增加检测人员对检测结果判定的可信度。试剂盒的重要技术指标主要有试剂盒的标准曲线、检测限、临界值、定量限、精密度以及准确度等。

1 酶联免疫的基本原理及特点

酶联免疫吸附方法主要是将酶的高效催化作用和抗原-抗体免疫反应的特异性进行有机结合，因为酶的作用出现颜色反应，然后通过现代光学分析仪器对光度进行测定[1]。因此酶联免疫吸附方法是一种非常灵敏和专属的测试手段。

酶联免疫吸附法的分类很多，按照其基本的反应原理主要可以分为间接法、抗体夹心法、捕获法以及竞争法。在兽药残留检测过程中经常用的测定方法是竞争法，这种方法主要针对测定小分子化合物[2]。根据试验的步骤不同可以分为间接法和直接竞争法两种。该方法可以用来测定抗体也可以用来定量的测定抗原和半抗原[3]。比如以抗原为例，其主要过程就是将异性的抗体吸附在固相载体上，然后加入一定量酶标和待测抗原，二者相互之间竞争和固相抗体进行结合；然后经过洗涤，加入底物溶液就可以产生显色反应。酶标抗原和固相抗体发生充分结合，其分解的底物颜色很深。待测抗原量变多的时候，竞争性的产生抑制，阻碍了酶标抗原和固相抗体产生结合，因此固相抗体上的酶标抗原量就变少，颜色就变浅[4]。

酶联免疫吸附法其特点也非常显著，主要有以下几个方面：反应的灵敏度非常高，因为酶的催化效率非常高，这就对于反应的效果起到了极大的推动作用，直接使得测定方法达到了非常高的敏感度；在检测样品的时数量非常大，因为其每个试剂盒都有96个孔，如果按照样品和标准品都做平行计算的话，那么每个试剂盒一次性可以检测42个样品，这数量非常可观，有利于直接提高检测的效率；检测的流程变得比较简单，一般情况下组织样品前需要处理时间为2～3 h，利于试剂盒进行检测的时间约为1.5 h，比如对于尿液样品来说一般都是直接去清澈样本直接进行试剂盒检测需时约为1.5 h，这就直接使检测流程变得简单易操作，复杂性大幅降低；检测限值比较低，比如沙丁胺醇和盐酸克伦特罗的检测限值都在0.3～0.5 μg·kg-1，这对于防止出现假阴性样品或者假阳性样品起到了非常有效的积极作用，能够很大程度上保障检测结果的准确率[5]。

2 兽药残留检测中ELISA的操作要点分析

酶联免疫吸附法（ELISA）检测结果是否可靠准确的前提保障就是稳定的试剂盒、适宜的环境、成熟的方法。

2.1 试剂盒选择及操作环境要求

试剂盒选择必须选用经过我国农业部备案的产品，对其质量要做好验证工作，对同一种的检测参数因为国内外出现的多种试剂盒也应通过检测回收率进行多方面的验证工作，这有利于保障试剂盒的效果和质量[6]。对于ELISA的操作环境也需要给予充分的关注，因为吸光度值受到温度的影响很大，随着温度的升高，吸光度值也会随着变大，这就可能出现假阳性。在检测的时候应该注意对于操作环境的要求标准，由于很多试剂盒都是在2～8℃的环境中保存，因此在使用之前一定要让试剂盒回温到20～25℃[7]。另外在检测前应该保证样品溶液的温度和标准溶液的温度，一般情况下都是将样品溶液和标准溶液放在同种温度下大约30 min。有的时候需要在特定的环境下进行检测，次数应该注意对于特定的温度和时间在试验的过程中不能随便的改动，因为这都是试剂盒在研制过程中经过很多次的试验最后得到的优化条件。

2.2 样品前期处理

一般情况下，样品在进行检测之前都应该进行前期的处理，主要包括均质、提取、离心和浓缩以及溶解等操作步骤[8]。在均质的操作中一般都是要去除和检测没有关系的一些组成部分，比如在检测“瘦肉精”的过程中，要除去脂肪的部分，只需提取肌肉部分。在进行组分提取的时候应该加入提取液，然后通过振荡以及涡旋等方法，让样品和提取液进行充分的混合，这能够有利于保障被测组分充分提取；在离心分离的时候也应该注意操作的时间和转速要达到规定的要求标准，如果没有达到标准的转速和合适的离心时间就可能导致提取失败。在离心和浓缩工作完成后，在有两相以上的分离时应该保证目的相不能带有其他的相，因为带入其他相越多就会导致出现假阴性率和假阳性率更高[9]。

2.3 试剂盒检测问题

对于要进行检测的试剂盒应该保障其在使用的有效期范围内，因不同的试剂盒反应的类型不同，而每个试剂盒都有不同的前期处理程序和操作程序，因此在检测前期应该详细阅读其自带的使用说明书，对于一些特别注意事项一定要给予更多的关注，比如试剂盒的保存条件，不同的试剂盒不可用混合使用等，保障检测的操作程序符合要求的标准[10]。然后在加样品的时候应该按照一定的顺序进行，不能随意颠倒顺序，要保证加入的样品时间是一致的，样品的量也要准确，加入的时候应该注意不能加到孔壁的上部，应该加在孔底，不能溅出也不能产生气泡。在加入样品以后应该进行轻敲酶标板的四周，然后在桌面上进行圆周运动，这有利于保证进行充分的混匀。洗板也是非常重要的一个环节，虽然这不是反应试验步骤，但也可以决定整个试验的成败，其目的主要就是洗去反应液中没有和抗体或者固相抗原结合的物质，并在反应过程中吸附在固相载体上的一些干扰的物质，如果洗涤不够彻底的时候，就可能导致有酶结合物的非特异性吸附，使得空白值增大很多。比如在进行孵育的时候一般都是要求在一定的温度下进行，为了防止溶剂的蒸发，就需要搞清楚试验示范需要避光孵育。而且在加入终止液以后随着时间的推移可能使得OD值变低，因此很多试剂盒都规定了在加入终止液后的读数有效时间范围[11]。

2.4 结果判断

因为酶联免疫吸附法在兽药残留检测过程中主要是用来进行筛选，其判定的标准有以下几个方面：现有的标准，采用方法的检测限作为判定的依据和标准；对于没有标准的，应该采用其他检测方法的检测限作为判定的标准，比如采用这种方法筛选出阳性样品通过确认的方法进行验证；应该添加阳性的质控样作为对比，这有利于排除基质效应的干扰[12]。

3 标准曲线

3.1 定量的验证方法

试剂盒中应含有不同浓度的标准溶液，使标准曲线至少有5个不同的浓度点，每个浓度测定次数不应低于5次；确定工作浓度范围和最大残留限量都在允许的范围内。IC50就是指抑制浓度为50%，也就是0浓度的标准溶液的吸光度值在50%的时候对应的药物浓度，这主要是反映了试剂盒的灵敏度。工作浓度范围主要是指样品中的药物浓度范围。

3.2 定性的验证方法

工作浓度范围主要是由阳性样品、临界值浓度样品以及阴性样品进行测定最终得到的，对于每个浓度都应重复进行测定，次数应≥5次。浓度和响应值之间存在着正比例或者反比例的关系[13]。

4 定量限和检测限

定量限应大于图1标准曲线中的最低浓度点，根据试剂盒标注的检测方法进行相关测定。测定次数≥6次，最终的检测值应和试剂盒上的定量限制进行比较，而且还应注意不能通过外延的方法进行推理判断。首先称取20份空白样品，然后将空白样品根据试剂盒提供的检测方法来进行测定，将测定结果进行计算得到平均值，加3倍的标准差，就得到该试剂盒的检测限。应注意该试剂盒提供的检测限是否和得到的检测限相符[14]。

5 临界值

对于一些残留限量非常高的药物，常用的检测方法就是其临界值一般为20份样品添加MRL浓度，重复测定3次，计算平均值，然后减去1.64的标准差得到，也就是95%置信限出值。对于公认的一些禁用药物进行检测，应用临界值作为定量限，得到的值应达到本实验室操作的检测标准，否则认为不合格[15]。

6 交叉反应

交叉反应主要是指两种不同的抗原分子但相互之间具有相同的部分或者类似结构的抗原表位，彼此发生的反应。比如，一种药物B的反应率为100%，分别测定了其他各种药物的50%抑制浓度，那么就可以得到其公式为：

7 准确度和精密度

准确度主要用回收率来表示，回收率一般要＞40%或者试剂盒上标注的回收率数值。而精密度主要是通过变异系数来表示，按照前期预定数量的要求进行检测，然后计算出结果。对于禁用的药物其变异系数应该满足≤30%。对于每个平行样之间的变异系数应该满足≤25%。

8 保存期

保存期是依据保存条件通过稳定性试验结果最终确定的。一般情况下正常条件的保存都应该在0、1、2、3个月进行测定。然后可以依据保存期，在后期每间隔3个月进行1次测定。在此推荐考虑进行37℃的冻融和加速稳定性方面的试验。

9 小 结

总之，通过试验进行方法学检验后，对于试剂盒所标注的各项技术指标有了明确的评判标准，能够评判试剂盒是否真的能够满足国家有关标准的要求。如果实际检测结果和试剂盒标示的各项技术指标都是在允许的差值范围内，并能够达到国家相关标准要求，该试剂盒是合格产品，可以用来进行药物残留的检测验证。反之，如果检测的结果和试剂盒标示的各项指标超过了允许的差值范围，则可以评判该试剂盒不合格，不能用来进行药物的残留检测[16-19]。

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