山鸡H5N1高致病性禽流感免疫效价评估试验

2018-05-04,,,,

畜禽业 2018年3期

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(1.上海市奉贤区动物疫病预防控制中心，上海奉贤 201400；2.上海欣灏珍禽育种有限公司，上海奉贤 201403)

0 引言

山鸡，俗称野鸡、学名雉，是一种在我国广泛分布的小型鸟类，其外貌绚丽多彩、肉质细嫩鲜美、野味浓郁醇厚、营养丰富齐全，具有较高的经济和观赏价值；而且山鸡的抗病能力较强，野外生活几乎无疾病发生。

近年来，随着社会发展和物质生活水平的不断提高，人们对名特优新产品的需求也不断增长，而山鸡作为其中的典型代表,成为了人们的首选，市场需求与日俱增，人工养殖的规模和数量逐年上升；据不完全统计，目前国内存栏商品种山鸡约200万套，年上市商品肉山鸡近亿羽、商品山鸡蛋约5亿枚，成为了特种养殖中规模最大的品种。

山鸡的规模化人工养殖，有效缓解了市场需求和生态保护的压力，但高密度的人工饲养，在加速山鸡抗病能力退化的同时，也显著增加了各类疾病的发生概率，特别是高致病性禽流感等主要疫病，已严重危害了产业的发展。而目前国内还没有一套专门的山鸡高致病性禽流感的免疫程序，也未见系统开展山鸡高致病性禽流感免疫抗体消涨规律研究的报导，养殖户基本都是参照家禽的推荐免疫程序进行免疫，免疫失败现象时有发生。为此，作者根据多年从事山鸡养殖和疾病防控的经验，经过精心设计和组织准备，开展了一轮针对山鸡H5N1高致病性禽流感全周期免疫效价的评估试验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验山鸡

上海某大型山鸡育种公司1日龄祖代种山鸡苗雏1万羽，2016年7月2日出雏；其入孵种蛋为43周龄健康种母山鸡所产，并严格按照孵化流程入孵。

种母山鸡已按原免疫程序分别于33日龄、69日龄和194日龄实施重组禽流感病毒H5亚型(Re-6株+Re-8株)二价灭活疫苗强制免疫。

1.1.2 免疫疫苗

(1)首免。疫苗名称：重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(Re-6株+Re-8株)；批准文号:兽药生字(2016)150132250；生产商：青岛易邦生物工程有限公司；批号：160960204；有效期：2016年11月11日。

(2)二免。疫苗名称：重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(Re-6株+Re-8株)；批准文号:兽药生字(2016)150132250；生产商：青岛易邦生物工程有限公司；批号：160960204；有效期：2016年11月11日。

(3)三免。疫苗名称：重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(Re-6株+Re-8株)；批准文号:兽药生字(2016)150132250；生产商：青岛易邦生物工程有限公司；批号：170320206；有效期：2018年1月23日。

(4)种母鸡三免。疫苗名称：重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(Re-6株+Re-8株)；批准文号:兽药生字(2016)150132250；生产商：青岛易邦生物工程有限公司；批号：160960204；有效期：2016年11月11日。

1.1.3 检测试剂

(1)抗原。禽流感病毒H5N1亚型(Re-6株)血凝抑制试验抗原：哈尔滨维科生物技术开发公司生产，批号：2016005，抗原效价为210。

禽流感病毒H5N1亚型(Re-8株)血凝抑制试验抗原：哈尔滨维科生物技术开发公司生产，批号：2016006，抗原效价为210。

(2)标准阳性血清。禽流感病毒H5N1亚型(Re-6株)HI试验阳性对照血清：哈尔滨维科生物技术开发公司生产，批号：2016002。

禽流感病毒H5N1亚型(Re-8株)HI试验阳性对照血清：哈尔滨维科生物技术开发公司生产，批号：2016001。

(3)标准阴性血清。禽流感病毒H5N1亚型(Re-6株)HI试验阴性对照血清：哈尔滨维科生物技术开发公司生产，批号：2015005。

禽流感病毒H5N1亚型(Re-8株)HI试验阴性对照血清：哈尔滨维科生物技术开发公司生产，批号：2015003。

(4)红细胞。1%鸡红细胞悬液：采集无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡全血，与等体积阿氏液混合，用pH值7.2、0.01moL/L PBS液洗涤3次，每次均以2 500～3 000 rpm/min离心5min，洗涤后用PBS液配成1%鸡红细胞悬液，2℃～8℃冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 试验山鸡饲养

(1)育雏期饲养方式。0～35日龄为育雏期；雏山鸡采用四层叠层式立体育雏笼饲养。

(2)保育期饲养。36～55日龄为保育期，采用双层阶梯式保育笼饲养。

(3)育成期饲养。分育成前期和育成后期二个阶段，其中：56～120日龄为育成前期，采用暗光照地面平养方式饲养；121日龄至开产(一般在190～195日龄)为育成后期，又称为产蛋准备期；采用三层叠层单鸡单笼式种山鸡笼饲养。

(4)种用期。开产至淘汰(一般持续种用至56周龄全群淘汰)为种用期。采用三层叠层单鸡单笼式种山鸡笼饲养。

1.2.2 免疫

根据H5N1高致病性禽流感推荐免疫程序，结合山鸡生理特性和饲养特点，试验过程沿用该公司原先使用的免疫程序对试验山鸡全群进行H5N1高致病性禽流感强制免疫。

(1)首免。33日龄，重组禽流感病毒H5亚型(Re-6株+Re-8株)二价灭活疫苗，剂量0.2 mL/羽，免疫方式为颈部皮下注射。

(2)二免。69日龄，重组禽流感病毒H5亚型(Re-6+Re-8)二价灭活疫苗，剂量0.5 mL/羽，免疫方式为胸部肌肉注射。

(3)三免。194日龄，重组禽流感病毒H5亚型(Re-6+Re-8)二价灭活疫苗，剂量0.5 mL/羽，免疫方式为胸部肌肉注射。

1.2.3 采样与样品处理

(1)种母山鸡采样。对该批试验山鸡的上一世代种母山鸡，在留取种蛋(43周龄)时随机采取20份血液样品。

(2)育雏期采样。对刚出壳0日龄雏山鸡，随机抽取20羽苗雏采血；以后每隔10 d随机抽取20羽雏山鸡采取血样，共采集0日龄、10日龄、20日龄、30日龄四个批次、80份血样；由于雏山鸡体型偏小，此期采血可取心脏采血的方法或直接颈动脉放血采样。

(3)育成期及后续样品采集。育成期60日龄时随机采取20份血样，以后每隔30 d在试验山鸡群中随机采取20份血样，共采集60日龄、90日龄、120日龄、150日龄、180日龄、210日龄、240日龄、270日龄、300日龄和330日龄等10个批次、200份血样。

(4)样品处理与保存。整个试验共采集试验山鸡14个批次、280份血液样品和43周龄种母山鸡1个批次、20份血液样品，总数为15个批次、300份血液样品；每个批次样品在采集后立即分离血清，标记后冷冻保存；至全部15个批次血样全部采集完成后集中监测。

1.2.4 样品检测

(1)检测方法。抗体检测：按照《高致病性禽流感诊断技术》国家标准(GB/T18936-2003)，所有300份血清样品在同一时间采用血凝抑制试验(HI)同步进行H5亚型Re-6株和Re-8株禽流感抗体检测。

(2)评定标准。待检血清样品经血凝抑制试验检测，HI滴度效价≥4 log2判为抗体合格。

2 结果与分析

2.1 结果

2.1.1 种母山鸡1个批次样品免疫抗体检测结果

43周龄种母山鸡的20份血样经检测，Re-6株抗体全部合格，合格率100%，HI平均值6.85，其中最高值为10 log2；Re-8株抗体有1份样品不合格，合格率95%，HI平均值4.7，其中最高值为8 log2；详细结果见表1。

表1 种母山鸡抗体检测结果汇总表

2.1.2 试验山鸡14个批次样品抗体检测结果

(1)各批次样品抗体检测HI均值。经检测，试验山鸡14个批次的样品中，Re-6株和Re-8株的HI均值最高批次均为210日龄批次，分别达到11.45 log2和11.6 log2；而HI均值最低的批次，Re-6株为30日龄批次，仅为0.1 log2，Re-8株为10日龄批次，为3.25 log2，详见表2。各批次抗体检测HI均值的变化(抗体消长)情况见图1。

表2 试验山鸡各批次样品抗体检测HI均值汇总表

图1 试验山鸡各批次样品抗体检测HI均值折线图

(2)各批次样品抗体检测阳性合格结果。14批次280份样品抗体检测结果中，Re-6株的抗体阳性合格样品数为215份，总阳性合格率为76.8%；Re-8株的抗体阳性合格样品数为259份，总阳性合格率为92.5%；各批次样品抗体检测阳性合格情况见表3。各批次样品抗体检测阳性合格变化情况见图2。

表3 试验山鸡各批次样品抗体检测阳性合格率汇总表

图2 各批次样品抗体检测阳性合格率变化情况折线图

2.2 分析

2.2.1 种母山鸡免疫抗体分析

从表1可见，43周龄种母山鸡的20份血样中，Re-6株的抗体阳性率达到了100%，且HI平均值达6.85 log2，高于4 log2的合格标准；Re-8株的抗体阳性率为95%，虽然有1份样品的HI值为0，但群体HI平均值仍达到4.7 log2，超过了4 log2的合格标准。

经过3次强制免疫的种母山鸡，其H5N1高致病性禽流感Re-6株和Re-8株的免疫抗体HI值较高，抗体阳性合格率也达到了95%以上，超过了70%的群体合格标准。

2.2.2 试验山鸡各阶段免疫抗体分析

(1)母源抗体。分析表2和表3发现，由于种母山鸡的免疫抗体水平较高，初生(0日龄)雏鸡均获得了较高的母源抗体，Re-6株和Re-8株的抗体阳性率分别达到100%和95%，与种母山鸡的抗体合格率相当，而且HI平均值也与种母山鸡的HI平均值较接近。但雏山鸡母源抗体的消失速度较快，10日龄后Re-6株和Re-8株的母源抗体HI平均值均低于4 log2的合格标准，而且群体的阳性合格率也低于了70%的群体合格标准，说明此时的试验鸡群已处于高危时期，应予免疫。

由于山鸡的个体较小，目前养殖户采用的传统免疫程序均为33日龄左右首免；因此从表2中可以看到，30日龄时Re-6株的母源抗体几乎为0 ，图一中可直观见到Re-6株 30日龄的抗体HI值已下降至0点；而Re-8株则在10日龄达到低谷后，在20日龄和30日龄2个批次的样品检测中，抗体HI值呈现了一个逐步上升的现象，但此时试验鸡群未曾开展相关免疫、已未见任何异常，这一现象有待作进一步探讨。

(2)免疫抗体。从表2和表3中还可看到，试验山鸡群33日龄实施首免后，Re-6株的免疫抗体HI值快速上升至8.9 log2，在第二次免疫后持续上升至9.3 log2，达到第一个高峰值，群体阳性合格率达到100%，但这一较高的HI均值仅维持一个月左右即呈现快速下降，2个月后(180日龄)的HI值跌已至1.75 log2的低值，且群体合格率也仅为30%，明显低于70%的合格标准。

Re-8株的表现则有所不同，其在首免后的免疫抗体快速上升，并在60日龄时也达到了第一个高峰值，且HI均值达到了10.35 log2、远高于Re-6株的8.9 log2，群体阳性合格率也先于Re-6株达到100%，以后Re-8株的抗体水平逐渐稳步下降，即使是69日龄加强免疫也未见抗体HI值有明显的变化，但HI均值下降的速度较慢，4个月后(180日龄)仍保持在合格标准以上(HI均值为4.95 log2)。

开产前进行第二次加强免疫后，Re-6株和Re-8株的HI均值分别达到了11.45和11.6的高峰值(实验室检测的最高值为12 log2)，随后免疫抗体稳定且缓慢下降，直至淘汰仍保持较高水平。

(3)雏山鸡Re-6和Re-8两毒株的母源抗体水平较高，但消退较快，在10日龄时HI均值即低于4 log2的有效保护标准，而且Re-6株的母源抗体持续快速下降，在30日龄时降至0；而Re-8株的抗体在10日龄后表现了一个异常的反弹，HI均值甚至超过了初始母源抗体的的水平。

33日龄首免后，两毒株抗体均快速上升，且Re-6株在二免后有一个小幅的提升，但免疫抗体在短期稳定后的消退速度较快；Re-8株则对二次免疫无明显反应，但抗体消退速度较慢、幅度较小，且一直保持在有效保护标准以上。三免后，二毒株的抗体水平呈现了稳定的同步上升和消退趋势，且持续保持较高抗体水平，直至淘汰。