铜仁市猪瘟病毒抗体的免疫水平监测

张俊波，印双红，陆安法，白 明，任品开，吴橙耀，李利霞

（ 1．铜仁学院 农林工程与规划学院，贵州 铜仁 554300；2．铜仁学院 大健康学院，贵州 铜仁 554300；3．铜仁市动物疫病预防控制中心，贵州 铜仁 554300）

0.引言

猪瘟又称烂肠瘟，一种由猪瘟病毒引起猪的强烈接触性、致死性传染病。由于猪瘟病毒的入侵导致猪的小血管变性，而造成猪的内脏器官出血、坏死和梗塞[1]。该病因具有强烈的致死性和传染性、发病无季节性，给养猪业造成严重的经济损失，已被列入世界卫生组织（OIE）疫病名录，并声明该病为必须申报的传染病[2]。

猪瘟病毒在世界范围内广泛传播，我国是世界上养猪业较大的国家，所以也是受猪瘟影响较为严重的国家，每年因猪瘟致死的猪占总病猪的30%，造成的经济损失高达100个亿[3]。参照相关文献，关于猪瘟的记载最早出现于1833年美国的俄亥俄州，随后在胸利亚、日本等国家发现并研究，但是猪瘟的控制都没有取得很好的成绩。直到1933年，丹麦首次宣布了无猪瘟疫情，随后瑞典、挪威、爱尔兰等13个国家宣布无猪瘟疫情。近年来，一些宣布已消灭猪瘟的国家又见猪瘟复发的报道[4-5]。猪瘟在我国的相关研究和报道最早于1925年，东南大学研究了CSF免疫血清[6-7]。1956年研制出了一种有效防控猪瘟疫情，对猪无毒但具有猪瘟免疫原形的活疫苗猪瘟兔化弱毒疫苗。使经免疫的猪具有持久免疫能力，也减少了被其他病毒感染的概率。它弥补了灭活疫苗免疫期短，免疫能力低等缺陷。因此，该疫苗被认为是最具有安全性和免疫原性最好的疫苗[8]。至今该疫苗仍被许多国家应用于猪瘟病毒的防控。

1965年，我国提出了彻底消除猪瘟的计划，经过全国许多专家学者的不懈努力，我国在猪瘟的防控方面取得了非常大的成绩。但是目前猪瘟仍然广泛流行于我国大部分地区，要彻底消灭猪瘟仍然很遥远[9]。铜仁市是一个少数民族地区，以猪肉为主要肉食，由于地方经济比较落后，猪场规模不大，一般为一百多头猪的小规模猪场，而铜仁市各个县城和市区猪肉市场主要由这些猪场维持，所以这些猪场的猪是否健康直接影响每个县城和市区人民的健康。关于铜仁市猪瘟免疫方面的研究较少，除了2011年吴高奇等对铜仁市特种野猪规模养殖场猪瘟免疫抗体水平进行监测外，没有其他的相关资料，而且该文献显示，铜仁地区特种猪免疫水平比较低，为了减少猪瘟给铜仁市养猪业带来的损失，养猪业遵循“预防为主，防重于治”的有效方针，所以全面了解铜仁市猪市场猪瘟免疫水平显得至关重要。结合铜仁市各地区养猪场规模特点，于2015年5、11月对铜仁市8个县、两区的各乡（镇）随机抽取23个养猪场进行春、秋两次猪瘟血清抗体水平定点检测工作，为铜仁地区猪瘟的防控提供科学依据。

1．材料与方法

1．1．样品来源

随机抽取的铜仁市8各县两区（碧江区（3个）、万山区（1个）、思南县（3个）、松桃县（3个）、德江县（2个）、印江县（2个）、石阡县（3个）、沿河县（2个）、江口县（1个）、玉屏县（3个）)共23个100来头规模大小的猪场定点场，每个猪场随机采取20份猪血清。

1．2．材料与仪器

1．2．1．试剂与器材

猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒（由武汉科前生物制品有限责任公司提供，批号，20121012，20130110，20130902）。

1．2．2．主要仪器

振动器；自动酶标仪（美国 BioTek仪器有限公司）；单道微量移液枪（eppendorf公司）；8道微量移液枪（thrmo公司）；恒温培养箱（北京市光明医疗仪器厂）。

1．3．方法

1．3．1．样品采集

血清共分为2次均等采集，分别是2015年5月、2015年11月。对选定的猪进行前腔静脉采血，方法分为三个步骤，如下：

（1）猪的保定：对中大猪的保定：用保定绳套住猪的上腭，将绳子斜向上，至猪的颈部皮肤充分崩紧，左右显出两个较深的窝。对仔猪的保定：直接仰卧。

（2）进针采血：将猪保定好中大猪后，选取左右两个窝中较深的一个作为进针点，选定进针点，用碘酊消毒，手持一次性采血盛血器，从对侧肩胛骨呈45°方向刺入，抽取5 mL血液。

（3）血清制备：抽取血液完后立即置于 30℃左右环境，倾斜静置半小时左右，每份吸取血清1 mL于1.5 mL EP管，做好标记，-20℃保存。

1．3．2．间接ELISA原理

在试验中加入稀释的对照血清和待测血清，经温育后，若样品中含有猪瘟病毒的特异性抗体，则与包被板上的抗原结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分，再加入羊抗猪酶标二抗，与包被板上抗原抗体复合物发生特异性结合，再经洗涤除去未结合的酶结合物，加入底物与抗原抗体复合物发生特异性避光反应10 min，再加入终止液，运用酶标仪测出OD值，即可得到该猪血清的病毒效价。具体操作如下：

检测前的准备2 h：

（1）解冻，取出冷冻的待测血清置于室温（20～25℃），充分解冻后，震荡混匀以备用。

（2）将冷藏保存的试剂盒放置室温，使其恢复至室温（20～25℃），备用。

（3）根据实际需要量将洗涤液稀释20倍盛于烧杯中，备用。

检测操作：

（4）将待检血清稀释20倍。用8道微量移液枪取样品稀释液195 μL于稀释孔中，再逐孔加入待检血清5 μL，记录对应的编号，置于震荡器上混匀。

（5）吸取 100 μL稀释好的待检血清于抗原包被孔，贴好封口膜，于37℃恒温培养箱温育30 min。

（6）温育结束后，倒掉抗原包被孔中的液体，在滤纸上拍干。每孔加入200μL稀释好的洗涤液，在室温下放置5 min，倒掉洗涤液，拍干。如此重复5次。

（7）洗涤结束后，每个抗原包被孔中加入100 μL羊抗猪酶标二抗，贴上封口膜，置于37℃恒温培养箱中，温育30 min。

（8）按步骤（6）的操作方法再次进行洗涤。

（9）洗涤完后，充分拍干包被孔中的液体，先后加入底物A和底物B各50μL，贴上封口膜，避光显色10min。

（10）显色后加入终止液5 μL，10 min内用酶标仪测定630 nm波长的吸光度值。

1．3．3．结果转换

严格按照试剂盒使用说明书上的步骤测定其样品OD值。根据试剂盒说明书，按表1进行OD值与抗体效价的转换。

表1 猪瘟抗体OD值与猪瘟间接血凝试验（HIA）效价的转换Tab.1 Conversion of OD value of swine fever antibody ELISA and the titer of swine fever Indirect Hemagglutination Test(HIA)

2．结果与分析

2．1．铜仁市猪瘟血清采样数量

本次实验包括春、秋两次猪瘟血清监测，共采集猪血清920份，检测结果中阳性血清有831份。通过对铜仁市八个县、两区定点猪场的猪瘟血清ELISA抗体检测（表2）。

表2 不同地区猪瘟抗体采样数量Tab.2 Swine fever antibody samples of different regions

2．2．铜仁市猪瘟抗体总阳性率结果分析

该市春季猪瘟血清检测的460份样品中，阳性血清40份，占总阳性率为88.91%，平均阳性率为88.33%；秋季检测的460份血清中阳性血清422份，总阳性率为91.73%，平均血清阳性率89.16%。碧江区、万山区、思南县、松桃县、德江县、印江县、石阡县、沿河县、江口县、玉屏县的春季阳性率依次为：90.00%、80.00%、100%、76.67%、72.50%、100%、100%、82.50%、95.00%、86.67%；秋季阳性率依次为：93.33%、70.00%、95.00%、83.33%、80.00%、95.00%、100.00%、100.00%、75.00%、100.00%（表3）。

表3 不同地区猪瘟阳性抗体统计Tab.3 Swine fever antibodies of different areas

春季抗体效价为1:32以下的血清占总样本的11.09%（秋季为8.26%），春季抗体效价为1:32的血清占总样本的25.00%（秋季为23.79%），春季抗体效价为1:64的血清占总样本的28.70%（秋季为31.52%），抗体效价为1:128的血清占总样本的23.26%（秋季为23.79%），抗体效价为1:256的血清占总样本的11.96%（秋季为13.26%）（表4）。从春秋季节猪瘟抗体水平结果可以看出，秋季的猪瘟抗体的免疫水平较高。

表4 不同抗体滴度的样本数及比例统计表Tab.4 The number and proportion of samples of different antibody titers

2．3．不同地区猪瘟抗体水平结果分析

以抗体效价≥1:32为阳性血清，阳性抗体所占比例较高的为石阡县，春秋两季的阳性血清比例均为100%，其阳性率最高。万山区春秋两季的阳性率都小于80%，是阳性率最低的地区。血清阳性率达100%，春季包括思南、印江，秋季包括石阡县、沿河县和玉屏县。阳性率达90%以上的，春季包括碧江区（90.00%）、江口县（95.00%)；秋季包括碧江区（93.33%）、思南县（95.00%）、印江县（95.00%），秋季血清阳性率较低有松桃（76.67%）和德江（72.50%）（表5）。

表5 不同地区春秋季抗体水平样品数统计表Tab.5 The number of samples of antibody level in different regions in Spring and Autumn

春、秋季血清阳性率增大较多的地区，主要表现为抗体效价≥1:32的比例减少，抗体效价为≥1:64、≥1:128、≥1:256的比例增大；血清阳性率增加较少的地区抗体效价≥1:32的比例增大，抗体效价≥1:64以上的比例变化很小；血清阳性率减少的地区中抗体效价为≥1:256比例减小。从各个区县总体来看，猪瘟抗体秋季阳性率和阳性水平均高于春季（表6和表 7）。

表6 春季不同地区猪瘟抗体抗体水平样品比例Tab.6 Sample ratio of classical swine fever antibody antibody level in different regions in Spring

表7 秋季不同地区猪瘟抗体水平样品比例Tab.7 Sample ratio of classical swine fever antibody level in different regions in Autumn

2．4．不同类型猪猪瘟抗体水平结果分析

对不同类型猪瘟抗体阳性率进行分析，结果显示，公猪血清抗阳性率93.10%，阳性率最高；其次是保育猪，血清阳性率为91.78%，然后依次是：母猪为90.28%，育肥猪为89.30%，哺乳仔猪为89.14%（表8）。哺乳仔猪血清阳性率最低。从整体水平上分析，各类猪血清阳性率存在差异。

表8 不同类型猪猪瘟阳性率Tab.8 Swine fever positive rates of different types of pigs

3．讨论

根据《免疫计划》中存栏猪猪瘟抗体的合格率≥70%为标准，铜仁各地区检测中万山区（秋70.00%）阳性率最低，已达到《免疫计划》的标准，铜仁市猪瘟抗体水平保护力较高。邹正举[10]采用猪瘟正向间接血凝实验赤水市猪瘟血清进行免疫抗体水平监测，结果显示，赤水市猪瘟抗体合格率为83.19%，诸庆言等[11]在瓮安县猪瘟抗体检测情况分析与对策中，对36各规模猪场和256户养殖户猪瘟血清检测，抗体效价≥1:32的血清占总样本的91.22%。简秀利[12]在贵州规模猪场的三种疫病调查与分析中，对2011年到2013年全省猪瘟抗体进行了调查，结果显示平均抗体水平为73.60%，其中2011最低，为51.00%。马晓燕等[13]对新疆地区进行抗体水平监测，新疆地区的猪瘟抗体合格率为71.30%。程汉等[14]对江苏泰州地区的猪瘟抗体水平检测显示，江苏泰州地区猪瘟病毒阳性率为79.3%。刘建营等[15]对广东地区年猪瘟抗体水平检测，结果显示，广东地区的猪瘟抗体阳性率占76.50%。以上相关文献显示，猪瘟抗体水平在省内外一些地区比较低。

从总阳性率水平分析，铜仁市免疫水平较高，保护力较强。相关文献显示，猪瘟抗体效价在≥1:32能抵抗强病毒感染。但对于猪瘟病毒这种强烈致死性和高度传染性病毒，只要猪瘟病毒存在于猪场，就是非常危险的。只要存在，该病毒就可能在抗体水平较低或没有达到阳性水平的猪之间传播，抗体水平较低的猪对猪瘟病毒有抵抗能力，但抵抗能力不强，使之成为带病猪，表现为免疫耐受。带病猪也可能通过饮食、大小便直接将病毒传递给共同食宿的低于阳性水平的猪，使免疫抗体不合格的猪感染猪瘟。为了减少种种导致猪感染的可能，力求每个养猪场猪瘟抗体阳性率达100%。

造成部分猪场猪瘟免疫效果不佳的原因可能是：在标准的免疫程序生产管理模式下，铜仁市各地区规模猪场还存在管理不规范、免疫剂量不足、疫苗质量不高、防疫意识不强、操作技术不到位等。简秀利[12]对贵州三种疫病的研究，许追[16]对四个试验猪场 CSFV、PRRSV和PCV-2混合感染情况的调查表明，猪瘟常常与猪圆环病、猪蓝耳病等病症混合感染，即混合感染等因素，使场内部分猪免疫不合格，个别地区猪场不合格猪占较大的比例。针对现有的这些问题，各地区畜牧局应加大对各地猪场猪瘟及其他疫病的监测，对饲养管理员进行免疫相关知识的培训普及，聘请专业人员进行免疫操作的指导，加大对混合感染方面的研究，提出对本地区特定的不同日龄猪免疫剂量防控措施，使各地区猪场都有属于自己科学免疫疗程，使铜仁市猪瘟抗体水平提高并保持在更高的水平。

4．结论

综上所述，目前铜仁市猪瘟抗体水平较高，保护力较强，但是免疫效果还没有达到预计的水平，该血清学调查为铜仁市猪瘟的防控奠定了基础。

参考文献：

[1]蔡宝祥．家畜传染病学（第四版）[M]．北京：中国农业出版社，2001：201-206．

[2]张瑞琴．山西猪瘟抗体水平调查及野毒株E2遗传变异多样性分析[D]．长春：吉林大学：1-3．

[3]徐磊．猪瘟兔化弱毒细胞疫苗和脾淋苗细胞免疫效果的比较[D]．福州：福建农林大学，2009：1-6．

[4]BJORKIUND H,LOWINGS P,STADEJEK T,et al,Phylogenetic comparison and molecμLar epidemiology of classical swine fever virus[J].Virus Genes.1999,19(3):189-195.

[5]STADEJEK T.Genetic heterogeneity of classical swine fever virus in centra1 Europe[J].Virus Res.1997,52:195-204.

[6]殷震，刘景华．动物病毒学（第二版）[M]．北京：科学出版社，1997，656-657．

[7]斯特劳BE，阿莱尔SD，蒙加林 WL，等．猪病学（第八版）[M]．朱冰学，赵德明，张中秋，等译，北京：中国农业大学出版社，2000：157-171．

[8]胡鸿惠，娄高明．猪瘟疫苗研究进展[J]．中国畜牧兽医，2012，39（4）：196．

[9]斯特劳．猪病学（第九版）[M]．北京：中国农业大学出版社，2008，313-341．

[10]邹正举．赤水市猪瘟免疫抗体监测[J]．贵州畜牧兽医2012，36（4）：35-36．

[11]诸庆衍，袁明娅，李天恒．瓮安县猪瘟监测情况分析与对策[J]．湖北畜牧兽医，2012（10）：20-21．

[12]简秀利．贵州规模猪场三种主要疫病调查情况与分析[J]．中国动物保健，2014（10）：26-28．

[13]马晓燕，彭晓玲，吕春花，等．新疆地区猪瘟血清型监测与分析[J]．新疆农业科学，2013，50（2）：378-382．

[14]马强，任巧玲，王治方，等．超前免疫对仔猪猪瘟抗体水平的影响[J]．中国畜牧兽医，2010，37（5）：188-190．

[15]卢广新，孙鹏．猪瘟最新研究进展[J]．山东畜牧兽医，2008，138（7）：43-44．

[16]许追．石河子地区猪瘟病毒的免疫抗体水平监测及实验室诊断[D]．石河子：石河子大学，2014：36-43．