水体重金属在斑马鱼(Danio rerio)组织中的累积及对抗氧化系统的影响——以浑河为例

赵光辉，常文越，刘 智，张依然，马珊珊

(1.沈阳环境科学研究院，辽宁沈阳 110167;2.辽宁省城市生态重点实验室，辽宁沈阳 110167；3.中国科学院沈阳应用生态研究所，辽宁沈阳 110016；4.中国科学院大学，北京 100049)

浑河沈阳段又名沈水，对沈阳市的地下水补给、景观、农灌、泄洪及城市生态环境调节起着不可替代的作用。目前，随着工业和技术的进步与发展，各类污染物通过一系列途径进入水体环境，对环境中的生物体产生极大影响，对生态系统的平衡造成严重威胁。近年来，关于浑河的相关研究主要包括浑河流域重金属的含量、分布状况及来源的研究以及浑河流域沉积物中重金属分布特征及对底栖动物的影响研究[1-3]。而关于浑河水环境重金属对水生生物的生态健康影响的研究还相对较少，尤其是对鱼类等水生生物的生态毒理的研究相对较少。

鱼类对水体环境的变化十分敏感，因而被广泛用于水体污染物的监测及评价中。斑马鱼(Daniorerio)作为研究水体的模式生物，其特点主要有：体型小，对饲养水质要求不高，繁殖周期短，易饲养及获取，对微量污染物反应灵敏[4]。当鱼体所处的水环境受污染物影响时，鱼体内的抗氧化机制被充分调动，进而保护机体自身免受过量活性氧的损伤。其中，重要的抗氧化因子包括超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、过氧化氢酶(CAT)[5]。丙二醛(MDA)可以指示机体内脂质过氧化的程度，间接反映细胞损伤的程度[6]。另外，乙酰胆碱酯酶(AChE)是水生生物神经毒性效应的重要标志物[7]。总抗氧化能力(T-AOC)代表在受到胁迫后，机体的防御能力[8]。Na+/K+-ATPase是一项广泛用于评价污染压力的参数[9]。相关文献报道，污染物与生物体自由基的产生、自由基清除系统的激活、谷胱甘肽代谢等存在必然联系，以上指标被认为是快速灵敏反映环境胁迫对生物体影响的生物标志物，被广泛应用于水体生态毒理研究及生态污染风险评价中，在诊断环境污染问题中发挥着重要作用[4]。笔者选用斑马鱼作为试验生物，在取样测定浑河水样金属元素含量的基础上，研究了水体重金属对斑马鱼脑、鳃、肝、肠、肌肉组织的SOD、CAT、GSH、GST、MDA、AChE、T-AOC以及Na+/K+-ATPase活性的影响，旨在筛选敏感的生物标记物，为分析评估水体综合影响与生态系统健康提供毒理学数据资料。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物。斑马鱼平均体长为(2.13±0.06)cm，平均体重为(105.42±8.00)mg。试验前暂养7 d，使其适应实验室环境，每天投喂基础饲料2次，连续曝气。光暗周期比为16∶8 h，水温为(24±2)℃，pH 7.6～8.0，溶解氧 >8 mg/L，硬度以CaCO3计为(250±25)mg/L。养殖期间，斑马鱼活动正常，无病，死亡率低于3%。

1.1.2试剂。SOD、GSH、GST、CAT、MDA、AChE、T-AOC和Na+K+-ATPase试剂盒均购自南京建成生物工程研究所[10-14]。

1.2方法

1.2.1试验设计。试验对照组用水为经过24 h自然曝气的自来水，处理组用水为定期采集的浑河水(五里河公园，地理坐标为123.45E、41.76N)。每组设置3个鱼箱(0.4 m×0.4 m×0.6 m)作为重复。每箱放斑马鱼100尾，试验期间每7 d换1次水，胁迫时间为90 d。

1.2.2样品采集与处理。采用常规解剖方法获取斑马鱼的脑、鳃、肝、肠、肌肉等组织样品。由于斑马鱼体型较小，为便于分析，将10尾鱼合并为1个样品进行分析测定。

浑河水样及斑马鱼组织样品的消解均在消解炉上进行。Al、Cr、Cu、Fe、Mg、Mn、Zn金属元素的测定使用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)。测定过程中严格遵守方法的有效性及质量控制，样品加标回收后误差范围在±10%内。

1.3数据统计所得的数据以平均值±标准差(mean ± SD)表示，采用SPSS 17.0统计软件进行独立样本T-test分析。

2 结果与分析

2.1水体中重金属元素含量浑河沈阳城市段水体中各金属元素含量见表1。独立样本T-test分析结果显示，浑河水与对照水相比，Cu、Fe、Mn、Zn含量差异显著。浑河水中Cu、Fe、Mn、Zn含量均值分别为0.01、0.295、0.064、0.104 mg/L，符合中国地表水环境质量 Ⅱ 类水质标准(Fe和Mn符合集中式生活饮用水地表水源地补充项目标准限值)。但与对照组相比，Cu、Fe、Mn、Zn含量分别高出42.9%、217.2%、77.8%和96.2%。

2.2斑马鱼各组织中的重金属元素累积量斑马鱼不同组织中的重金属元素累积量见表2。由于不同金属对生物体生命作用的不同，斑马鱼各组织中各类金属含量差异不同。除肌肉组织外，各重金属元素含量为：Fe>Zn>Mn>Cu。由于鱼体内各组织器官生理功能和代谢水平存在差异，对于同一种金属而言，在不同组织中的含量也存在显著差异。Cu在斑马鱼组织中的含量为：肝>肠>脑>鳃>肌肉。Fe在斑马鱼组织中的含量为：肝>肠>鳃>脑>肌肉。Mn在斑马鱼组织中的含量为：肝>鳃>肌肉>脑>肠。Zn在斑马鱼组织中的含量为：肌肉>肝>鳃>肠>脑。

对于Cu、Fe、Mn、Zn来说，累积的主要组织是斑马鱼的肝组织。浑河水养殖的斑马鱼肝组织中Cu、Fe、Mn、Zn含量分别是对照组的1.6倍、1.9倍、5.5倍和1.5倍。肝脏是鱼的消化和代谢器官，对重金属的代谢起着非常重要的作用。因为肝脏的解毒作用，组织内可诱导产生大量束缚金属的金属硫蛋白MT，使肝成为体内蓄积金属的主要部位[15]。影响重金属在生物体内累积的因素很多，包括重金属元素的性质、生物种类、生物发育的不同阶段以及食物链等对生物累积均有不同程度的影响。在同等条件下，重金属元素的性质对生物的影响往往十分明显，有些重金属对某些组织具有较高的亲和性，或与某些内源性物质(如蛋白质或多肽)结合性高，可以较长时期存留在生物组织内，并在一定时间内不断积累增多。例如，Paulami等[16]研究了Cu、Zn、Cd、Pb 和Cr 在尼罗罗非鱼肌肉、鱼卵、肾脏、肝脏、鱼鳃和鱼鳍中的累积。结果表明，Pb 和Cd 在所有的组织器官累积量都无显著差异，具有相似的累积模式。Cu在肝脏和鱼卵中积累较多，在组织器官中的累积为：鱼卵>肝脏>鱼鳃>肌肉>肾脏；Zn在鱼鳍、鱼鳃、鱼卵、肝脏中积累较多，而在肾脏中积累较少，累积大小顺序为：鱼卵>鱼鳍>鱼鳃>肝脏>肌肉>肾脏。贺亮等[17]采用火焰原子吸收分光光度法研究了重金属Cu在鲫鱼体内不同组织的积累情况，发现Cu在鲫鱼各组织中的累积能力为：内脏>鱼鳃>肌肉。该研究得出的肝组织是主要的累积组织的结论与前人的研究结果相似[16-18]。

表1浑河沈阳城市段水体中各金属元素含量

注：*表示处理组与对照组相比差异显著。a表示世界卫生组织饮用水水质标准(2004)；b表示中国饮用水卫生标准(2005)；c表示中国地表水环境质量标准CSWQS，GB3838—2002

Note：Asterisks indicated statistical significance of comparison between the treatment group and the control (P<0.05).a.Guidelines for Drinking-Water Quality,World Health Organization (2004);b.Sanitary Standard for Drinking Water,China (2005);c.Quality Standard for Surface Water,China.CSWQS,GB3838-2002

2.3水中重金属对斑马鱼各组织中抗氧化酶、MDA、AChE、T-AOC和Na+K+-ATPase含量的影响酶类是生物体内所有生化反应的中间体，任何的生化反应都可以通过酶活性来了解生化反应的变化。该研究通过测定斑马鱼各组织的酶活性来了解重金属对鱼体机能的影响程度。由图1可知，斑马鱼鳃、肝、肠组织中，SOD和CAT活性均出现显著诱导，肝组织中SOD和CAT增加率分别为109.1%和32.0%。SOD是金属酶，属于铜酶，研究表明低浓度的铜可以诱导CAT活性的增加，一方面可能是由于累积在鱼体内的重金属激发大量的过氧化物，另一方面可能是受SOD的应激反应发生[14]。浑河水中Cu含量高于对照组42.9%，其胁迫作用使生物体产生大量含氧自由基，斑马鱼机体产生SOD清除含氧自由基，是抵抗外界刺激的一种防御机制[19-20]。这与宋志慧等[20]的研究结果一致：0.01 mg/L Cu2+暴露斑马鱼1 d，SOD、CAT活性增加，显著高于对照组，且Cu2+对CAT时间影响因子比较大。而戴家银等[24]研究表明，真鲷幼鱼暴露于不同浓度的Cu和Zn 4 d后，对鳃和肝脏的CAT都有抑制作用，与该研究结果相反，这可能是由于受不同暴露浓度和暴露时间影响所致。

表2 水体重金属对斑马鱼脑、鳃、肝、肠、肌肉组织各金属元素含量的影响

注：*P<0.05

Note：*P<0.05

注：*P<0.05 Note:*P<0.05图1 水体重金属作用对斑马鱼脑、鳃、肝、肠、肌肉组织SOD、GSH、GST、CAT、MDA、AChE、T-AOC和Na+K+-ATPase的影响Fig.1 Levels of SOD,GSH,GST,CAT,MDA,AChE,T-AOC and Na+K+-ATPase in brain,gills,liver,intestine and muscle of zebrafish after heavy metals stress in water

T-AOC是近年研究发现的用于衡量机体抗氧化酶系统和非酶促系统功能状况的综合性指标，它的大小可代表和反映机体抗氧化酶系统和非酶系统对外来刺激的代偿能力以及机体自由基代谢的状态[19-24]。该研究中，处理组斑马鱼各组织中T-AOC显著下降，说明各组织抗氧化能力下降。马莉芳[23]研究表明，黄河鲤长时间暴露于高铜溶液中，可降低T-AOC的活力。

鳃组织中MDA显著升高了59.2%，表明水体重金属引起脂质过氧化，诱导了斑马鱼鳃组织的氧化损伤。

斑马鱼脑和肌肉组织中的Na+K+-ATPase活性显著下降，说明在处理组水体环境中，斑马鱼能量得不到充足的供应，代谢活动受到干扰，抵抗力降低，加速组织的衰老及死亡。鲁双庆等[9]研究表明，鱼的肝脏是主要的解毒器官，当鱼处于Cu2+污染环境中，Cu2+会随着血液循环进入肝脏，与肝组织中某些重要酶的活性基团结合，对肝脏的生理活动产生影响。另外，该研究中，斑马鱼鳃组织GSH显著升高，肌肉组织GST显著下降，脑、肠和肌肉组织的AChE活性显著降低。GST在解毒环境污染物这种外源性亲电物质中挥发着主要的作用[25]。氧化胁迫增加GST，这是一种细胞抗氧化胁迫的防御机制[26]，但是当这种胁迫超过细胞的防御能力时，GST降低。麦穗鱼鳃组织中GSH浓度的改变表明，浑河水中重金属的作用影响了麦穗鱼的抗氧化功能，类似的研究结果也有报道[27]。AChE是存在于中枢或外围神经系统的重要神经递质[28]，AChE活性的抑制已经被作为神经毒性的标志物[29]。鱼暴露于毒性物质后，通常会观察到AChE活性显著降低，通过抑制AChE的活性，累积乙酰胆碱，影响鱼的游动和生殖行为[30]。

研究中浑河水胁迫斑马鱼的酶活性发生显著变化，是受多种金属离子联合作用的结果。而金属离子的联合作用比较复杂，其联合毒性作用效应不仅与污染物的组成有关，也与测试生物有关。此外，不同的作用时间及毒性配比也会产生不同的结果。实际的水环境更为复杂，即使相同毒物不同时间下毒性作用也会发生变化[31]。因此，单一及联合重金属对水生生物的作用有待进一步研究。

3 结论

浑河水中Cu、Fe、Mn、Zn含量符合我国地表水环境质量 Ⅱ 类水质标准，与对照组相比分别高出42.9%、217.2%、77.8%和96.2%。

浑河水胁迫下的斑马鱼各组织中，重金属呈现不同程度的累积，肝组织累积量最高。

浑河水胁迫下的斑马鱼肝组织中SOD和CAT增加率分别为109.1%和32.0%，T-AOC显著下降28.5%，说明肝组织抗氧化能力下降。斑马鱼鳃组织中MDA显著升高59.2%，表明斑马鱼鳃组织明显的氧化损伤。

斑马鱼肝鳃组织较为敏感，SOD、CAT、T-AOC及MDA可作为敏感的毒理学研究的生物标志物，通过检测能够反映重金属共同作用对斑马鱼的生态健康影响，对水体综合毒性进行早期预警，同时也可作为有效的水环境污染监测参考指标。

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