鱼类血细胞研究进展

晋 伟，刘逸尘，张树花，胡锦丽，任星潮，张亦陈

(天津市动植物抗性重点实验室/天津师范大学生命科学学院，天津 300387)

鱼类血液承担着气体交换、物质运输、免疫防御等多种功能，是机体的重要组成部分。血细胞是血液的主要成分，是血液中各种功能分子的大本营，而各类血细胞也遵循特定的发生发展规律，从产生、分化到成熟每个环节都受到严格调控，但这些机制尚未完全解析，因此对鱼类免疫系统的认识也尚不够充分。鱼类血细胞具有自身特殊性，如不易单独去除的有核红细胞、部分外周血细胞仍具有分裂能力等，加上鱼类是较为低等的脊椎动物，因此使得人类医学血液学的很多规律在鱼类中并不完全适用，需要利用新思路和新方法对鱼类血细胞相关的诸多问题开展系统研究。笔者从血细胞的发生、发育及分化、功能及研究方法4个方面综述了鱼类血细胞研究进展，并对其今后的研究方向进行了展望。

1 鱼类血细胞的发生场所

从系统发生的角度来看，早期的低等动物一般以血管、肠、体腔壁等部位进行造血，随着个体、器官及组织的进化，脾脏、肝脏、骨髓等逐步发展出造血功能[1]。软骨鱼类缺乏骨髓和淋巴结,因此利用胸腺、脾脏、性腺周围的薄壁囊体(epigonal organ)以及特殊的淋巴样组织莱迪希器(Leydig’s organ)等造血[2]。对多数硬骨鱼类而言，骨髓腔虽已形成，但尚无造血机能。鱼类血细胞研究大多集中于原始期到成熟期的发育过程，而在此之前的干细胞和之后的衰老过程的研究鲜有报道[3]。目前，大多数学者是通过观察相应器官中原始期血细胞的种类和数量来判断其是否为该类细胞的造血器官。林光华等[4]提出应在原始期血细胞存在的前提下，以原始期、幼稚期和成熟期3个阶段血细胞的百分比来判断血细胞的发生场所。金丽等[3]在长吻鮠脾脏和肾脏的印迹片中发现特定细胞分布有明显集群现象，推测是脾脏或肾脏在结构上存在类似于人类骨髓中造血岛的结构，是血细胞的生发中心。陈晓耘[5]在南方鲶幼鱼的研究中提出，随着幼鱼到成鱼的发育，造血器官会出现迁移和变化。因为鱼种、品系或生存环境的不同，血细胞的发生、形态、功能等方面存在各种差异[6]，所以对于同类对象的研究结果有时也不尽相同。目前大多数研究支持肾和脾在硬骨鱼类造血过程中起主要作用，其中肾小管之间以及肾小管与集合管之间的管间组织区是肾脏的造血区，脾髓、窦状隙、小肠的黏膜下区分别是脾脏、肝脏和小肠的造血区，此外肝胰脏、肠黏膜下组织和胸腺也具备造血功能。表1为已发表的部分鱼种各血细胞的主要造血部位[5，7-12]。另外，在外周血中常可见到血栓细胞以集群的形式出现，但在各器官中很难发现其相关发育证据。

2 鱼类血细胞的发育过程及分化水平

鱼类血细胞的分类和命名主要参考哺乳动物，利用瑞氏(Wright)-吉姆萨(Giemsa)染色方法，根据细胞内各组分、胞质内颗粒及其他成分的染色特征和细胞大小形态，将鱼类血细胞分为红细胞和白细胞，其中白细胞可进一步分为淋巴细胞、单核细胞和颗粒细胞。鱼类血细胞也有特定的发育过程，通常将其分为原始阶段、幼稚阶段和成熟阶段[8，13-15]。粒细胞发育比较复杂，形态变化也比较大，所以通常将其幼稚型又分为早、中、晚3型，随着研究的深入，部分研究者还将幼稚阶段红细胞分为早幼和晚幼2个阶段[5，9]。血栓细胞是较为特殊的一个类群，目前对其是否归属于白细胞的看法尚不统一，其发育过程也不清楚。

2.1红细胞系鱼类血液中红细胞占血细胞总量的90%以上[16]。与哺乳动物的无核成熟红细胞不同，除了未发现红细胞的南极冰鱼(Cryodracoantarcticus)以及具有无核小红细胞的Maurolicusmüelleri等极特殊种类外[2]，几乎所有鱼类的红细胞都是有核的椭圆形细胞，核呈圆形或椭圆形，且核越细长表明红细胞越成熟。软骨鱼类的红细胞要比硬骨鱼类的更大更圆[17]。鱼类红细胞的发育会经历原红细胞、幼红细胞、成红细胞3个阶段。幼红细胞呈圆形或卵圆形，比原红细胞稍小，细胞核为卵圆形，核仁不清晰，染色质多以常染色质状态存在，此时细胞内转录比较活跃，正在大量合成血红蛋白；成熟红细胞也呈圆形或卵圆形，较幼红细胞更大一些，核仁已经消失，此时的细胞质中含有大量的血红蛋白，染色质凝集固缩以异染色质状态存在且不再表达[13]。兴国红鲤[12]、暗纹东方鲀[15]、军曹鱼[18]等的红细胞在成熟过程中胞体由大变小再变大，而泥鳅[19]、团头鲂[20]的红细胞则由小变大再变小。在日本黄姑鱼[8]、暗纹东方鲀[15]、大弹涂鱼[21]、淇河鲫鱼[22]等的外周血涂片中，均可检出处于分裂期的红细胞或未成熟的红细胞，说明红细胞除了在造血器官中生成外，也可以通过分裂增殖的方式得到补充。另外，未成熟的红细胞出现在外周血液中这种现象，也表明外周血可能是红细胞进一步成熟的场所。

表1 鱼类各血细胞主要造血器官

2.2淋巴细胞系淋巴细胞是鱼类白细胞中最常见的一种，通常被分为大、小淋巴细胞，其中较小的淋巴细胞更为成熟。淋巴细胞呈圆形或不规则圆形，细胞核中染色质稠密，核质比极大，边缘是浅蓝色的胞浆，细胞表面常见伪足[17，23]。电镜观察下，鱼类淋巴细胞的胞质内具有大型的线粒体、游离的核糖体或粗面型内质网，有的还有高尔基体、溶酶体和吞饮泡等[24]。鲫鱼[25]、鲤鱼[26]淋巴细胞的超微结构和哺乳动物以及其他低等脊椎动物具有相似的形态特征，推测淋巴细胞的结构在物种的系统发生过程中改变不大。淋巴细胞的发育也会经历原、幼和成熟3个阶段，细胞一般从大变小，但泥鳅[19]、大弹涂鱼[21]等胞体先变大再变小，核仁逐渐消失，染色质凝集固缩，着色逐渐加深，胞质着色逐渐变浅。

2.3单核细胞系在鱼类白细胞中，单核细胞的大小仅次于巨噬细胞和一些大型的嗜碱性粒细胞。细胞形态通常为近圆形，胞核多为圆形或肾形，偏于细胞一侧，染色质疏松，胞浆丰富，其中常可见大小不等的空泡。由于单核细胞大小和形态与较大的淋巴细胞相似，所以在区分时常会出现误差。通常情况下，单核细胞的体积更大，核质比更小。电镜下，胞质内有较多的线粒体，有时还有高尔基体、粗面型内质网、核糖体以及被吞噬的衰老细胞或其细胞核等[16]。单核细胞发育也经历从原始到成熟的3个阶段。细胞体积先变大再变小，如兴国红鲤[12]、草鱼[27]等，但在花尾胡椒鲷[11]、大弹涂鱼[21]等中发现细胞体积先变小再变大，胞核逐渐缩小，染色质从疏网状逐渐变为致密网状。

2.4粒细胞系中性粒细胞在大多数鱼类的颗粒细胞中占比最大，大多为圆形，核呈不规则状，常见圆形、椭圆形、肾形及分叶形等，普遍偏于细胞一侧，核质比小。胞浆可能为透明、浅蓝色或灰色，散布有许多透明或轻微染色的颗粒。嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞在外周血中少见，常出现于肾脏和脾脏中[13，28]。嗜酸性粒细胞略大于中性粒细胞，偏心核多呈肾形或分叶形。嗜碱性细胞略小，呈圆形，胞浆中嗜碱性颗粒常紧密堆积，以致于细胞核被遮盖住[17，23]。大多数鱼类都有嗜中性粒细胞，少数鱼类外周血中仅发现有嗜碱性粒细胞[15，29]或嗜酸性粒细胞[5，11]，而军曹鱼[18]、大弹涂鱼[21]等在外周血中均未发现嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。袁仕取等[30]认为，鱼类外周血液中颗粒细胞的种类、数量及其形态结构存在明显的种间差异。徐豪等[31]指出嗜碱性粒细胞的嗜碱性颗粒极易溶于水，制片过程中易解体，因此很难见到。目前常将3种粒细胞放在一起讨论其发生过程。Fijan[32]推测粒细胞可能起源于共同的祖细胞。粒细胞的发育较为复杂，一般会经历原粒细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细胞、成熟粒细胞这5个阶段。在发育过程中胞体先变小再变大，在早幼粒细胞胞质内最早出现嗜天青颗粒，随着粒细胞的逐渐成熟，嗜中性颗粒和嗜酸性颗粒逐步增多，早幼粒细胞逐渐分化成嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和嗜碱性粒细胞，胞核的形状变化从圆形到半圆形，后来又出现肾形，直至成熟后的粒细胞中出现分叶状和杆状的核。外周血涂片中偶有晚幼粒细胞和成熟的粒细胞，说明晚幼细胞能进入外周血中继续成熟，直至衰退。这与红细胞类似，说明外周血可能是其造血器官的终点[13]。金丽等[3]发现不规则核型的中性粒细胞在外周血中少见，但在组织器官中发现较多，推测可能是因为粒细胞需要在内脏中发挥某种功能，也有可能是粒细胞衰老的一种信号。

2.5血细胞分化水平鱼类血细胞可能在进入外周血后进一步发育成熟。陈晓耘[5]认为鱼类的血细胞发育水平处在类似于高等脊椎动物血细胞幼稚阶段的晚期。血细胞较低的分化水平应是鱼类作为低等脊椎动物的特点之一。另外，鱼类血细胞是否起源于共同的干细胞以及成熟细胞的程序性衰老、凋亡等问题也需要深入探讨，从而完善对鱼类血细胞发生、发展、成熟直至衰老全过程的系统了解。

3 鱼类血细胞的功能

血细胞的功能与维持体内各种生理环境的稳定性有密切关系,鱼类的血细胞具有吞噬、分泌等功能，可参与机体的伤口修复、防御等生理过程[33]。

鱼类红细胞的显著特点是体积较大且有细胞核。例如，虹鳟和鲫鱼的红细胞平均长径分别约为16和14 μm，平均短径分别约为9.5和7.6 μm；小鼠、兔以及狗的红细胞最大长度只有5.7～7.0 μm。另外，鱼类红细胞的数量为1.4×105～36.0×105/mm3，比兔、狗及鼠要少得多[34]。相对而言，进化水平越高的生物，红细胞越小且数量越多。体积较小的红细胞实际上增加了其比表面积，促进了内外交换。此外，哺乳动物红细胞的核随着进化消失，可以减少自身呼吸量，从而提高携氧效率。鱼类红细胞的主要功能与哺乳动物类似，包括气体输送及维护体内离子平衡等[35]。另外，王旭东等[36]推测鱼类的有核红细胞还可作为免疫细胞，具有一定的吞噬功能，因此有时也表现出一定的非特异性免疫功能。

鱼类的白细胞包括无颗粒白细胞和有颗粒白细胞两大类，前者分为淋巴细胞和单核细胞，其中单核细胞和粒细胞较大，淋巴细胞较小。淋巴细胞普遍被分为大淋巴细胞和小淋巴细胞，但有观点认为淋巴细胞大小的差异是由于同一种细胞处于不同发育阶段或执行不同功能的状态[37]。Ellis[38]和Warr等[39]报道了鱼类膜表面免疫球蛋白(SmIg)，表明鱼类淋巴细胞可能具有T、B细胞分化；陈昌福[40]发现鲤鱼的淋巴细胞存在SmIg和胸腺淋巴细胞表面抗原(CATLC)2种细胞类型；Partula[41]和Scapigliati等[42]相继利用单克隆抗体发现鱼类淋巴细胞存在表面抗原与受体不同的T、B淋巴细胞。由此可见，鱼类淋巴细胞应该具有能被抗原激活而产生抗体和淋巴因子的功能。单核细胞变形能力活跃，可通过伪足样胞突捕获吞噬外来物质及衰老细胞。另外，鱼类被寄生虫感染会引起单核细胞数量的激增[39]，表明该类细胞的数量变化能在一定程度上提示宿主的感染来源。中性粒细胞是分化最早、数量最多的颗粒白细胞，能够通过伪足包裹异物形成吞噬小泡，其吞噬能力虽然没有单核细胞强，但由于其数量多，运动活跃，因此也是十分重要的鱼类非特异性免疫细胞。另外，中性粒细胞还在炎症反应中扮演重要角色，并且具有一定的趋化学性[40]。目前人们对鱼类嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的功能了解不多，在急性组织损伤或病原感染时，病灶部位常有大量嗜酸性粒细胞聚集，非特异性地吞噬病原和自身受损组织[43]。Ellis[38]发现嗜碱性颗粒含有肝素等化学物质，推测其可能与抗凝血作用相关。血栓细胞体较小，常态为圆形或椭圆形，核质比较大，胞浆清澈。由于外观与同样大小的淋巴细胞接近，因此有时会导致白细胞计数产生误差。在区分血栓细胞和淋巴细胞时，主要观察胞浆颜色，前者无色，后者为浅蓝色。激活的血栓细胞形状多变，可能与细胞成熟或激活的程度有关。该类细胞在外周血涂片上常成群分布，Forsythe[44]认为这是因为涂片过慢或此前血样已部分凝结。因为鱼类血栓细胞在造血器官中比较少见，所以目前还不确定其发育过程及发生场所。血栓细胞的功能类似于哺乳动物的血小板，分泌凝血酶使纤维蛋白原聚合，从而使其具有凝血作用。此外，血栓细胞归类的观点也不一致，袁仕取等[30]将血栓细胞划归为白细胞的一类，尾崎久雄[1]则认为血栓细胞应该单独划分一类。

4 鱼类血细胞研究方法

在鱼类血细胞研究中，常用的方法大致可分为依靠肉眼观察辨识的人工方法和依靠高通量仪器测量并借助软件分析的自动化方法。前者主要借助各类染色技术对细胞及其内部结构加以区分，或根据细胞密度梯度等易于辨识的差异进行分类，人工方法的结果常常存在因人而异的问题；自动化方法通常利用各类细胞表面或内部便于进行自动化检测的特征，对其进行甄别分类及统计，自动化方法虽然测量精度高，批次稳定性好，但也有检测指标局限等缺点。

4.1人工方法在对鱼类细胞基本形态特征的探索过程中，普遍将外周血涂片经罗氏(Romanowsky)染色改良过的瑞氏(Wright)-吉姆萨(Giemsa)等血细胞常规染色处理后进行显微镜观察。一些特异性生化组分的染色方法也经常被用来辅助区分不同类型的细胞，多糖(PAS)、酸性磷酸酶(AcP)、酸性非特异性酯酶(ANAE)、过氧化物酶(Pox)、碱性磷酸酶(AIP)以及利用苏丹黑(SB)辨识脂类等组织化学的染色较为常用，可以借此分析血细胞的成分、功能以及发育阶段等。例如，草鱼[27]红细胞整个发育过程中PAS反应呈阴性，处于原始阶段的白细胞呈阴性，此后在发育过程中逐渐呈阳性，说明较成熟的白细胞内糖原物质更为丰富。组织印迹片也是一种简便的方法，将组织断面直接印迹于玻片上并染色，可以快速了解局部的组织结构以及该部位的细胞种类和分布，非常适于观察组织器官内各阶段的血细胞状态，从而了解血细胞发育的规律。电子显微镜在亚细胞层面的结构特征分析方面无可取代，无论是扫描电镜还是透射电镜都能够清晰地显示细胞内部的各种细微结构，有助于丰富对细胞形态和胞内成分的认知。冰冻蚀刻是常用于扫描电镜的制样方法，醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色则多用于扫描电镜制样。

4.2自动化方法各种基于流式细胞技术的检测仪器被广泛应用于医学血液学的自动化检测分析，这些方法通常首先借助低渗的方法涨破无核红细胞，并通过离心收集剩余的白细胞群体，然后利用各种白细胞表面的特异性表位对其加以识别，或者通过细胞的导电性等方面的差异来区分不同种类的细胞。这些高精度检测器与流式上样技术配合使用，每分钟都能轻松获取成千上万细胞的测量数据，并根据预先设定的分群模型快速将其分开。有些流式细胞仪带有收集功能，便于快速富集某一特定类群的细胞，开展体外功能分析等研究。部分学者也在尝试将流式细胞技术用于鱼类血液学研究，但受限于不易去除的有核红细胞以及缺乏商用的白细胞特异性的抗体等，这类自动化技术的应用尚不普遍。Inoue等[45]将鲤鱼血细胞用纯水浸泡处理20 s以涨破红细胞，然后将剩余的白细胞通过流式分析分成多个类群，但尚未见到该方法广泛应用的报道。Pettersen等[46]将实验室制备的多种抗体用于鲑鱼血细胞的流式检测分析，探讨了鲑鱼头肾及脾脏在血细胞生成方面的差异。近年来，一类具有图像辅助功能的流式细胞仪逐渐崭露头角，借助其强大的同步图像采集功能，可以单独分析每一个细胞样点，在边界细胞划分方面具有独特优势。

5 展望

总体而言，鱼类血细胞的研究有赖于高等动物研究技术和成果的支持。长期的发展取得了丰硕的成果，但相对于精密复杂的鱼类免疫系统而言，只是刚看到轮廓，这其中鱼类血细胞的特殊性制约着现有方法的应用。高通量、自动化的测量技术是鱼类血细胞分析的一个重要发展方向，但占比极大又不易去除的有核红细胞的剥离以及大量适用于鱼类血细胞抗体的商业化是流式技术广泛应用的先决条件，迫切需要有重大技术创新来引领新发展。应考虑进一步借鉴新的技术手段，将图像辅助的流式细胞仪应用到鱼类血细胞分析中，有望实现红细胞类群的精准隔离；组学技术的巨大进步为生命科学各个领域的研究构筑了强大的技术支撑，抗体组的应用必将快速推进包括鱼类在内各个物种重要细胞类群的鉴别。

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