响应面法优化三百棒多糖提取工艺

2018-05-03杨年安陈安平

安徽农业科学 2018年12期

田瑞，夏燕，冯佳，杨年安，向阳，陈安平，袁林

(湖北民族学院风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北恩施 445000)

三百棒(ToddaliaasiaticdLam.)又名见血飞、大救驾等，为芸香科飞龙掌血属植物的根和根皮，主产于湖南、湖北、贵州、四川等地，非洲东部及亚洲东南部和南部均有分布。传统医学认为，三百棒具有活血散瘀、舒筋通络、消肿止痛的作用，常用于治疗跌打损伤、风湿痹痛、胃痛及痛经[1]。现代医学研究表明，三百棒具有治疗胃肠炎、抗肿瘤、抗炎镇痛及抑菌等作用[2-5]。

关于三百棒多糖的研究较少[6-7]。笔者采用响应面分析方法对三百棒多糖的提取工艺进行优化，旨在为三百棒多糖的提取工艺研究提供理论依据，同时对三百棒多糖的深入研究提供参考。

1 材料与方法

1.1材料三百棒采于湖北省恩施州咸丰县，经湖北民族学院附属民大医院制剂室张国安主任药师鉴定为飞龙掌血(ToddaliaasiaticaLam.)。蒽酮、葡萄糖、三氯甲烷、正丁醇、浓硫酸均为分析纯。

1.2仪器BILON-W420 数显三用恒温水箱，西安德派生物技术有限公司；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；离心机，eppendorf公司；TU-1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；冷冻干燥机(GOID-S2M),上海欧蒙实业有限公司。

1.3三百棒多糖的提取称取一定质量的三百棒干粉，加入适量的水，搅拌均匀，在一定温度下浸提一定时间，然后离心(3 000 r/min，10 min)，浓缩，醇沉4 ℃过夜，离心(3 000 r/min,10 min)，Sevage法脱蛋白[8]，然后浓缩挥发掉有机溶剂，真空冷冻干燥。

1.4单因素试验设定料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20(g∶mL)]、提取温度(40、60、80、100 ℃)、提取时间(2.0、3.0、4.0、5.0 h)、提取次数(2、3、4、5次)为自变量进行单因素试验。

1.5三百棒多糖含量的测定

1.5.1标准曲线的制作。采用蒽酮硫酸法[9]测定三百棒多糖含量。准确称取干燥恒重的葡萄糖标准品100 mg，定容于200 mL容量瓶，即得0.5 mg/mL葡萄糖标准溶液。分别吸取0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 mL标准葡萄糖溶液，用蒸馏水补至2.0 mL，以2.0 mL蒸馏水为空白，然后各自加入0.5及5.0 mL浓硫酸，摇匀，沸水浴1.0 min，630 nm处测定吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得标准曲线。标准曲线的回归方程为Y=0.008 0X+0.000 8,R2=0.999 2。

1.5.2样品多糖含量的测定。脱蛋白后，取5.0 mL定容于10.0 mL，量取0.5 mL，用蒸馏水补至2.0 mL，按照“1.5.1”的步骤测定吸光度。以标准曲线计算三百棒多糖含量。

1.6三百棒多糖提取的中心组合试验[10-11]在单因素试验的基础上，采用Box-Benhnken试验设计，用响应面软件Design Expert 8.05b分析料液比、提取温度、提取时间、提取次数4因素中影响较大的3水平，分别以-1、0、1表示，具体设计见表1。

2 结果与分析

2.1单因素试验结果由图1可知，随着料液比的增加，三百棒多糖的得率快速增加，当料液比达1∶15后，三百棒多糖的得率增加缓慢，可见增大料液比有利于三百棒多糖的提取，但增大到一定程度后，三百棒多糖的得率基本趋于稳定。

表1 Box-Bennhnken试验设计因素与水平

图1 料液比对三百棒多糖提取率的影响Fig.1 Effects of solid liquid ratio on extraction efficiency of Toddalia asiatica Lam.polysaccharides

由图2可知，随着温度增加，多糖的得率快速增加，温度达80 ℃后稍有下降，可能是由于高温条件下一部分多糖发生水解[12]，导致多糖损失，另外温度过高会使许多杂质含量增加，造成三百棒多糖的分离困难。由此可知，三百棒多糖的提取温度以80 ℃最好。

图2 提取温度对三百棒多糖提取率的影响Fig.2 Effects of extraction temperature on extraction efficiency of Toddalia asiatica Lam.polysaccharides

由图3可知，在一定提取时间内，三百棒多糖的得率随着时间的增加而增加，在4.0 h时达到最高，当提取时间达5.0 h时，多糖得率稍有下降，可能是因为时间过长导致三百棒多糖部分降解[13]，由此可知，三百棒多糖的提取时间以4 h最好。

由图4可知，三百棒多糖的得率随着提取次数的增加逐渐增加，但当提取次数达3次后，多糖的得率趋于稳定，并稍有下降，可见三百棒多糖的提取次数宜选择3次。

图3 提取时间对三百棒多糖提取率的影响Fig.3 Effects of extraction times on extraction efficiency of Toddalia asiatica Lam.’s polysaccharides(TALP)

图4 提取次数对三百棒多糖提取率的影响Fig.4 Effects of extraction times on extraction efficiency of Toddalia asiatica Lam.’s polysaccharides

2.2响应面试验结果结合单因素试验结果，采用Box-Benhnken中心组合试验法，选取料液比、提取温度、提取时间、提取次数因素中影响较大的4因素，进行4因素3水平的中心组合试验，以三百棒多糖得率为响应值，通过响应面分析优化三百棒多糖的提取工艺条件(表2)。

表2 Box-Benhnken试验设计及结果

利用Design Expert 8.05b软件对试验数据进行二次多元回归拟合，以料液比(X1)、提取温度(X2)、提取时间(X3)、提取次数(X4)为自变量，三百棒多糖提取率(Y)为响应值。其回归方程：

Y=4.540+0.140X1+0.440X2+0.170X3+0.400X4+0.190X1X2+0.070X1X3+0.062X1X4+0.033X2X3+0.057X2X4-0.015X3X4-0.200X12-0.530X22-0.150X32-0.290X42

利用Design Expert 8.05b软件对响应面结果进行回归拟合分析，并对回归方程的系数进行显著性检验。

2.3最佳条件优化及验证试验根据回归模型的分析结果，得到三百棒多糖提取的最佳工艺条件：料液比1∶14.87，提取温度93.16 ℃，提取时间3.85 h，提取次数3.83次，在该条件下三百棒多糖提取率的预测值为4.99%。考虑到实际操作情况，将最佳提取工艺修正为料液比1∶15，提取温度93 ℃，提取时间4 h，提取次数3次，在此条件下，三百棒多糖提取率为4.75%。预测值和实际值很接近，偏差较小，因此此响应面法优化得到的模型参数准确可靠(图5)。

3 结论

该试验通过对料液比、提取温度、提取时间、提取次数4个因素进行响应面分析，并由回归模型的方差分析结果可知4个因素的影响均显著。三百棒多糖的最佳提取工艺条件：料液比1∶15，提取温度93 ℃，提取时间4 h，提取次数3次。在此条件下得到的多糖提取率为4.75%，接近预测值4.99%，表明采用响应面法优化三百棒多糖的提取工艺准确可靠，科学可行，具有很好的参考价值。

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