两个可食鹅膏菌的形态学及rDNA～ITS测序鉴定

田慧敏，田博宇

（赤峰学院 生命科学学院，内蒙古 赤峰 024000）

鹅膏菌属(Amanita)隶属于担子菌门（Basidiomycotina）、层菌纲(Hymenomycetes）、伞菌目（Agaricales）、鹅膏菌科(A-manitaceae)，是有毒大型真菌中较特殊、较有价值的世界广布性大属，其物种具有非常丰富的多样性.全世界已描述且被承认的约500种，我国约80种[1].主要特征为菌盖初期卵形，后期呈凸透镜形或平展，菌盖常有外菌幕碎片残留，菌褶离生或近离生，白色，菌柄中生，易与菌盖分离，柄基部常常膨大成球形，菌环有或无，菌托环状，苞状或鳞片状，孢子印白色，孢子椭圆形，近球形，光滑，往往含一大油滴[2].鹅膏菌多与树木形成外生菌根，促进森林的发育，该属也有许多优质食用菌，如橙盖鹅膏A.caesarea有鸡蛋菌的美名，营养丰富，十分鲜美.然而大部分种具有毒性，含鹅膏毒肽、鬼笔毒肽、毒蝇碱，产生神经精神型中毒症状[3]，还有少数为剧毒菌，如白毒伞A.verna，号称“毁灭天使”.在世界各地每年都有人误食毒菌而死亡，而大多数死亡原因是误食了有毒鹅膏，因此鹅膏菌的准确鉴定尤为重要.传统鉴定方法往往受到环境的影响较大，因此菌物学家纷纷引入分子生物学手段对该属真菌进行物种鉴别，以期结果更加准确可靠[4～9].笔者对2个赤峰地区鹅膏菌标本利用形态学和ITS片段测序相结合的方法进行分类鉴定，为鹅膏菌的准确鉴定提供依据和方法.

1 材料与方法

1.1 标本来源

供试标本CFSZ10041、CFSZ10261由田慧敏等采自赤峰地区巴林右旗和松山区，拍摄生境照片后，晾干、编号，超低温冷冻处理后存放于赤峰学院菌物标本室（CFSZ）.

1.2 形态鉴定

鉴定方法采用宏观特征、显微结构与化学试剂反应相结合的方法.宏观特征子实体大小用游标卡尺测量新鲜子实体2-5个，使用体式显微镜观察菌盖菌柄附属物，颜色的判断主要依据采集时拍摄的彩色照片，显微观察通常4-5%KOH作浮载剂，测量担孢子30个、菌丝、担子、囊状细胞以20个为限.

1.3 ITS鉴定

1.3.1 基因组DNA的提取

采用CTAB法：子实体干品菌盖部分(含菌褶)用液氮研磨，提取基因组DNA[2]，并使用北京鼎国公司的DNA纯化试剂盒对提取的DNA 1.3.2 rDNA-ITS区进行PCR扩增及测序.

PCR的扩增体系为：PCRcolorlessmix25μL，ITS1(TCCGTAGGTG AACCTGCGG)/ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)引物（20μmol/L）各 1μL，模板 DNA2μL，ddH2O22μL，反应总体积为50μL.扩增反应在德国eppendorf公司的5331型PCR扩增仪上进行，94℃预变性3min；95℃变性 40s；58℃退火40s；72℃延伸1min，共34个循环；最后于72℃补平5min，终止温度为4℃.PCR产物纯化后委托上海生工生物科技有限公司完成.

1.3.1 ITS序列比较和系统发育分析

将已测得的ITS序列利用DNAMAN等处理后提交UNITE网站进行检索，将所得的相似序列转换为FASTA格式，用MEGA5.1软件中的Alignment程序对序列进行多重对位排比，并利用Analysis程序采用最大似然法构建系统发育树，用Kimura2-parameter模式计算遗传距离，Bootstrap循环1000次.

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定结果

经形态学鉴定结果CFSZ 10041为淡青灰鹅膏Amanita lividopallescens(Gillet)Bigeard&Guillemin，CFSZ 10261为杏黄鹅膏Amanita crocea(Quél.)Singer.

2.1.1 淡青灰鹅膏Amanita lividopallescens(Gillet)Bigeard&Guillemin

菌盖直径3.8～5.0cm，半球形或平展，灰白色至浅青灰色，中央色深，被白色，不规则形状的菌幕残片，易脱落，菌盖边缘有长条纹，干后条纹处稍变棕黄色，边缘撕裂，（图1～A），菌肉白色，薄，约 1～2mm，无明显气味，菌褶近离生，白色，有短菌褶，菌柄 8.0～11.3cm，粗 0.5～0.7cm，白色，有不明显的绒毛，干后绒毛变黄色，基部膨大近球形，菌托袋状或苞状，分裂成两瓣或多瓣，白色，具微细绒毛，有稀疏的黄褐色小疣，地下生，菌环缺如（图1～B）.

孢子 （7.2～）10.1～14.4×（6～）8.2～10 （～12.0）μm，[Q=1.00～1.57（～1.85），Q=1.23±0.21]，宽椭圆形或椭圆形，有的近球形，含一大油滴，有小尖，非淀粉质（图1～3）.担子33.6～57.6（～67.2）×10.1～14.4μm，无色，有黄色内含物，棒状，上部膨大，有四个小梗，基部无锁状联合（图1～4）.褶侧囊状体无，菌盖表皮由菌丝组成，往往顶端膨大，顶端细胞大小为 50.0～72.0×10.0～21.6μm（图 1～E）.菌幕由囊状细胞和菌丝组成，囊状细胞无色，20～42.4×14.0～18.0μm，无色薄壁菌丝，分枝，有隔膜，直径 2.9～4.8μm（图 1～F）.

研究标本：内蒙古赤峰市巴林右旗，赛罕乌拉自然保护区，东沟蒙古栎林CFSZ 10041，2013年8月12日，刘铁志、田慧敏等.

图1 A.lividopallescens(Gillet)Bigeard&Guillemin子实体形态及微观结构

与该种相似的其他灰色菌盖的鹅膏有A.vaginata、A.malleata和A.fraudolenta，但是A.vaginata菌盖深灰色，菌托袋状纯白色，有微细绒毛[10～11]，A.malleata 菌托质脆，易碎，A.fraudolenta菌柄具有褐色的线状覆盖物.而A.lividopallescens鉴别特点菌盖有碎片状菌幕残留，菌柄基部袋状有黄褐色小疣，且菌幕由囊状细胞和无色菌丝组成，孢子宽椭圆形至近球形Q=1.00～1.57[12～13].分子鉴定结果显示A.beckeri与该种亲缘关系近，但是从形态学角度，A.beckeri菌盖很黏，易剥离，灰棕色或赭褐色，菌盖菌幕片状，多，且由菌丝组成，故将该标本鉴定为A. lividopallescens，该种为鹅膏亚属（Subgenera Amanita）灰鹅膏组（Section Vaginatae）主要分布于欧洲橡树下，在我国首次发现，属中国新记录种，记载高温烹调后可食用[12].

2.1.3 杏黄鹅膏Amanita crocea(Quél.)Singer

子实体中等大，菌盖直径4.5～6.0cm，平展，湿时稍粘，橘黄色或杏黄色，中央色深，无菌幕，边缘有条纹，菌肉厚，白色，无特殊气味.菌褶白色，后变淡黄色，密，不等长.菌柄长 12.5～17.5cm，粗 0.7～1.3cm，圆柱形，基部稍膨大，白色，中空.无菌环，菌托白色，苞片状（图 2～A,B）.

孢子 9.6～12（～14.4）μm×（7.2～）8.4～10.0（～11.4）μm，[Q=1.50～2.14，Q=1.76±0.18]，椭圆形，近球形，表面光滑，有小尖，无色，无淀粉质反应（图2～C）.担子36.0～57.6×8.6～10.1μm，短棒状，中部膨大，（图 2～D），无囊状体，菌盖表皮由辐射状排列的菌丝组成，菌丝无色透明，直径8.4～14.4μm，有的顶端膨大，膨大细胞大小为36～50.4×11.5～15μm（图 2～E），菌柄表皮菌丝无色，常见 H 形，有的菌丝膨大成倒梨形，大小为 25～42×10.5～16μm（图 2～F）.

研究标本：内蒙古赤峰市巴林右旗，赛罕乌拉自然保护区，荣升景区，桦林地上散生CFSZ 10261，2013年8月14日，刘铁志、田慧敏等.

图2 杏黄鹅膏A.crocea(Quél.)Singer子实体形态及微观结构

该标本与A.fulva外形很像，但A.fulva菌盖具褐色色调，且有片状菌幕，而杏黄鹅膏A.crocea菌盖偏于橘黄色，菌盖无菌幕残留，记载可食[2,11,12].

2.2 ITS序列分析

将4个标本测得的ITS序列与通过BLAST检索比对从NCBI的GenBank数据库获得32个与供试鹅膏科具有较高相似度的物种（见表1）

2.3 系统发育分析

以鳞鹅膏组的A.manginiana作为外群，对CFSZ 10041、CFSZ 10261的ITS序列及相关序列等36个ITS序列构建系统发育树，结果聚为三类，分别为鹅膏亚属（Subg.Amanita）的鹅膏组（Sect.Amanita）、和鞘托鹅膏组（Sect.Vaginatae）和鳞鹅膏组（Sect.Lepidella），CFSZ 10041 和 A.lividopallescens聚在一起，支持率70%，CFSZ 10261与A.crocea聚在一类，支持率86%，都属于鞘托鹅膏组（Sect.Vaginatae）.

表1 与供试鹅膏属4个标本rDNA～ITS序列相似的物种

综合上述，形态学鉴定方法和ITS测序法相结合，将CFSZ10041鉴定为A.lividopallescens(Gillet)Bigeard&Guillemin,CFSZ10261为杏黄鹅膏A.crocea(Quél.)Singer.

图3 供试标本和其最相似物种的ITS序列构建的系统发育树

3 讨论

赤峰地区鹅膏科真菌资源丰富，鉴定方法主要以形态为主，本研究将传统形态鉴定法和rDNA～ITS序列测序分析法相结合鉴定两个常见鹅膏菌，鉴定结果相互补充印证，较为准确、科学，同时本研究发现了一个中国新记录种，该研究不仅对于认识我国东北地区鹅膏属的物种多样性具有较重要的科学意义.

参考文献：

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