五味子油超声辅助提取工艺优化及其护肝作用

王小宁 - 郝 晶 刘子晨 - 闫梦茹 - 张存劳 -

(西安医学院药学院，陕西 西安 710021)

肝损伤是常见的临床疾病之一。中国是肝病大国，多种急慢性肝病在中国均有较广分布，并且发病率呈逐年上升的趋势[1]。近年来，从植物中提取天然性成分护肝成为研究的热点[2]。五味子为木兰科植物五味子或华中五味子的干燥果实，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功能[3]。研究[4-5]表明，五味子对化学性、药物性、酒精性等不同类型的肝损伤具有不同程度的保护作用。白慧媛等[6]研究了五味子对氯氮平致小鼠肝损伤的保护作用，结果表明，五味子能减轻肝细胞的损伤，降低由氯氮平引起的AST和ALT增高。张锦楠等[7]的研究表明五味子果汁可以显著提高大鼠肝微粒体CYP450水平，增强肝脏代谢功能。汪丽君等[8]研究表明，五味子中的木脂素成分(包括五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素等)具有改善肝功能、减轻肝细胞脂质过氧化损伤的作用，是保肝作用的主要物质基础。丁传波等[9]从五味子藤茎中提取的木脂素能够有效缓解CCl4造成的小鼠急性肝损伤，其高剂量组的改善作用与联苯双酯相近。宋影影等[10]对五味子籽压榨油的成分及对酒精肝损伤的保护作用进行了研究，但关于五味子种籽油的提取工艺及种籽油对急性肝损伤的保护作用鲜有报道。本试验以五味子种籽为原料，用单因素和正交试验筛选最优种籽油的超声辅助提取工艺，高效液相色谱法分析其中木脂素成分的含量，并考察五味子种籽油对小鼠急性肝损伤的保护作用，为五味子的进一步开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

五味子：北五味子，陕西镇安瑞琪药材有限公司；

昆明白小鼠：SPF级，中国人民解放军第四军医大学实验动物中心；

五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素对照品：纯度99.46%，成都曼斯特生物科技有限公司；

甲醇：色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司；

乙酸乙酯、无水乙醇、正己烷、石油醚、四氯化碳：分析纯，天津富宇精细化工有限公司；

花生油：压榨一级，山东鲁花集团有限公司；

GSH、MDA、SOD试剂盒：南京建成科技有限公司；

肝泰乐：每片100 mg，北京太洋药业有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

万分之一电子分析天平：ALC-210.4型， 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；

超声波清洗器：KQ5200E型，昆山市超声仪器有限公司；

低速大容量离心机：TDL-5-A型，上海安亭科学仪器制造厂；

高效液相色谱仪：Agilent Tech-1260型，安捷伦科技有限公司；

旋转蒸发仪：R201L型，上海申生科技有限公司；

酶标仪：Multiskan Go型，赛默飞世尔科技有限公司；

循环水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)型，巩义市予华仪器有限公司；

紫外可见分光光度仪：CARY-60型，安捷伦科技(中国)有限公司。

1.2 五味子籽仁油超声辅助提取工艺的优化

1.2.1 五味子种籽的前处理 将干燥的五味子果实放入80 ℃ 的热水中浸泡2 h，搓出种籽去除果肉并清洗干净，阴干，将适量五味子种籽粉碎过16目筛，备用。

1.2.2 五味子种籽油的提取及提油率的测定 精密称取粉碎后的已称重五味子种籽(记为m)加入100 mL锥形瓶中，加入提取溶剂，超声一定时间。取一已称重(记为m1)的干燥洁净的圆底烧瓶，将提取得到的溶液抽滤后转移至圆底烧瓶中，旋转蒸发除去溶剂得五味子种籽油，并将烧瓶和油称重，记为m2，提油率按式(1)计算：

(1)

式中：

ER——提油率，%；

m1——烧瓶和油总质量， g；

m2——烧瓶质量， g；

m——五味子种籽的质量，g。

1.2.3 提取工艺的优化

(1) 单因素试验：以提油率为指标，依次考察溶剂种类(无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚、正己烷)、料液比[1∶10，1∶12，1∶15，1∶18，1∶20 (g/mL)]、提取时间(0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 h)、提取温度(20，30，40，50，60 ℃)、超声功率(40,60,80,100,120 W)5个因素对提油率的影响。当选定某一因素进行单因素试验时，其余各个因素的条件为：提取溶剂为正己烷，料液比1∶15 (g/mL)，提取时间2 h，提取温度30 ℃，超声功率80 W。

(2) 正交试验设计：根据单因素试验的结果，以提油率为考察指标，采用四因素三水平的正交试验优化提取工艺。

1.2.4 五味子种籽油中木脂素含量的测定 采用高效液相色谱法测定木脂素含量，测定方法根据文献[11]修改如下：绘制标准曲线：分别制备57.00 μg/mL的五味子甲素对照液、26.25 μg/mL的五味子乙素对照液、4.80 μg/mL的五味子醇甲对照液，各精密吸取上述3份对照品液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0 mL 于5 mL容量瓶中，用甲醇定容，得一系列浓度的对照品溶液。吸取上述溶液20 μL注入高效液相色谱仪，色谱条件为：Diamond C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相甲醇-水(体积比为80∶20)；流速1.0 mL/min；检测波长254 nm；进样量20 μL；柱温30 ℃。记录色谱图，进行线性回归，计算样品中木脂素的含量。

1.3 保肝作用及机制研究

1.3.1 试验分组 昆明白小鼠48只，体重18～22 g，随机分为6组，每组8只，雌雄各半。试验分组：五味子种籽油高剂量组(五味子种籽油2 g/kg)、中剂量组(五味子种籽油1 g/kg)、低剂量组(五味子种籽油0.5 g/kg)、阳性药物对照组(肝泰乐5.7 mg/mL)、肝损伤模型组以及正常对照组。

1.3.2 试药的配制

(1) 0.2% CCl4花生油溶液的配制：精密量取CCl40.2 g于100 mL烧杯中，加花生油定容，得0.2% CCl4花生油溶液。

(2) 24 mg/mL肝泰乐混悬液的配制：取肝泰乐片剂20片(重量为1.427 g)，研成细粉。精密称取肝泰乐粉末342.5 mg于10 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，用前充分摇匀，得浓度为5.7 mg/mL的药物溶液。

(3) 五味子种籽油花生油溶液的配制：分别称取五味子种籽油2.0，1.0，0.5 g于10 mL容量瓶中，加入花生油定容，摇匀，得浓度分别为200，100，50 mg/mL的五味子种籽油花生油溶液。

1.3.3 肝损伤模型的建立 在人工控制昼夜12 h，温度20.3～23.1 ℃，压差20 Pa(进风180 Pa，出风160 Pa)，相对湿度40%～60%的饲养条件下，先将小鼠进行1周的适应性喂养，然后进行连续7 d的给药，于给药的第1、4、7天灌喂0.2% CCl4花生油溶液造肝损伤模型，灌喂量为第1、7天10 mL/kg，第4天为5 mL/kg。

1.3.4 给药方案

(1) 五味子种籽油高、中、低剂量组给药方法：分别每天灌喂200，100，50 mg/mL五味子种籽油花生油溶液，灌喂量为10 mL/kg，按10 mL/kg灌喂蒸馏水作为空白组，并于给药的第1、4、7天灌喂0.2% CCl4花生油溶液。

(2) 阳性药物对照组给药方法：每天灌喂24 mg/mL肝泰乐混悬液10 mL/kg，每次灌喂时充分摇匀，同时灌喂花生油10 mL/kg作为对照，并于给药的第1、4、7天灌喂0.2% CCl4花生油溶液。

(3) 肝损伤模型组：每天灌喂花生油10 mL/kg、蒸馏水10 mL/kg作对照，并于给药的第1、4、7天灌喂0.2% CCl4花生油溶液。

(4) 正常对照组：每天灌喂花生油10 mL/kg，蒸馏水10 mL/kg，并于给药的第1、4、7天补灌其他组0.2% CCl4花生油溶液等量的花生油。

1.3.5 组织匀浆制备 最后一次灌喂CCl4，16 h后将小鼠断颈处死取出肝脏，于0.9%生理盐水中清洗去除剩余血液，切一小部分称重，按1∶9 (g/mL)比例加入生理盐水，在冰水浴中匀浆，充分匀浆后转移至离心管中5 000 r/min离心10 min，取上清液备用。

1.3.6 谷胱甘肽(GSH)含量测定 采用微量酶标法。通过谷胱甘肽还原酶把氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原成还原型谷胱甘肽(GSH)，而GSH可以和生色底物DTNB反应产生黄色的TNB和GSSG[12]。于405 nm处测定吸收度，计算GSH含量。

1.3.7 丙二醛(MDA)含量测定 过氧化物脂质降解产物中的MDA可与硫代巴比妥酸缩合，形成红色复合物，分光光度计532 nm处比色，计算MDA含量[12]。

1.3.8 超氧化歧化酶(SOD)活性测定 黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子，后者氧化羟氨形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈现紫红色，而SOD则抑制此反应，分光光度计550 nm处比色，计算SOD活性[13]。

1.3.9 肝脏病理检测 将标本进行石蜡包埋，制成4 m石蜡切片。经二甲苯脱蜡及梯度乙醇复水后，进行苏木素-伊红(HE)染色，再进行梯度乙醇脱水，脱水后将组织切片中的乙醇用二甲苯置换出来。最后滴加中性树胶封片，显微镜下观察、拍照。

2 结果与分析

2.1 提取工艺的优化结果

2.1.1 溶剂种类对五味子种籽油提取率的影响 图1结果表明，以正己烷为溶剂时五味子种籽油的提取率最高，因此选定正己烷为提取溶剂进行后续研究。

图1 溶剂种类对提油率的影响Figure 1 Effect of solvent types on extraction rate of seed oil

2.1.2 料液比对五味子种籽油提取率的影响 由图2可知，当溶剂达到饱和量后，提油率不再上升，继续增加溶剂量只会造成溶剂的浪费，因此，选定料液比为1∶15 (g/mL)进行后续研究。

图2 料液比对提油率的影响Figure 2 Effect of the ratio of solid to liquid on extraction rate of seed oil

2.1.3 超声功率对五味子种籽油提取率的影响 由图3可知，随着超声功率的增大，提油率逐渐增大，但当超声功率达到一定限度后，提油率下降。推测原因是超声功率过大，使得很多无效成分被提出，这些成分对油可能具有吸附作用，使油难以被提出。选择超声功率80 W进行后续研究。

图3 超声功率对提油率的影响Figure 3 Effect of the ultrasonic power on extraction rate of seed oil

2.1.4 提取时间对五味子种籽油提取率的影响 由图4可知，超声时间对提油率影响较明显，但当提取时间到达一定限度后，继续延长提取时间提油率不再上升，因此选择提取时间为2 h进行后续研究。

图4 提取时间对提油率的影响Figure 4 Effect of the extraction time on extraction rate of seed oil

2.1.5 提取温度对五味子种籽油提取率的影响 由图5可知，在整个温度范围内，五味子种籽油的提取率变化不大，从提油率结果和实际应用角度考虑，选择40 ℃为最优提取温度。

图5 提取温度对提油率的影响Figure 5 Effect of the temperature on extraction rate of seed oil

2.1.6 正交试验 根据单因素筛选得到的最优条件，以料液比、超声功率、提取时间、提取温度为因素，建立四因素三水平的正交试验，因素水平表见表1，正交试验及结果见表2，方差分析表见表3。

由表2可知，影响超声提取五味子种籽油提取效果的因素排序为B>A>D>C；由方差分析结果可知，超声功率对提油率具有显著影响(P<0.05)；最佳的工艺条件为A3B3C2D3，即料液比1∶18 (g/mL)、超声功率80 W、提取时间2 h、提取温度50 ℃。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

表2 正交试验及结果Table 2 L9(34) orthogonal test and data processing

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

2.1.7 验证实验 精密称取2 g同一批五味子种籽3份，分别置于3个锥形瓶中，按上述最优提取工艺，得到提油率分别为29.86%，30.0%，29.95%，平均提油率为29.94%，RSD值为0.25%，提取率高，工艺稳定。五味子种籽油中五味子甲素含量为4.00%，五味子乙素含量为1.95%，五味子醇甲含量为0.13%，与文献[14]中报道的数据相比，木脂素总含量高于五味子果实，具有较高的商业开发价值。

2.2 护肝作用研究

2.2.1 五味子种籽油对小鼠肝组织GSH、SOD及MDA活性的影响 CCl4在肝细胞色素P450氧化酶作用下，生成CCl3·和Cl·，CCl3·导致的脂质过氧化过程，被认为是引发肝损伤的主要机制[15]。自由基过度累积会引起细胞膜完整性和功能的丧失。SOD和GSH-Px是组成生物体体内酶促防御体系重要的抗氧化酶，它们能有效地清除活性氧自由基并终止自由基链式反应[16]。当肝细胞受到自由基攻击时，SOD、GSH会因过度消耗而逐渐减少。MDA是体内自由基攻击脂质产生脂质过氧化物的代谢终产物，MDA水平的高低可以反映细胞氧化损伤的程度[17]。由表4可知，与空白对照组比较，肝损伤模型组小鼠肝组织GSH和SOD水平显著降低(P<0.01)，MDA水平显著升高(P<0.01)，表明CCl4肝损伤模型造模成功，小鼠肝脏抗氧化能力降低，氧化应激增加。与肝损伤模型组比较，五味子种籽油低、中、高剂量和肝泰乐保肝药均可显著降低肝组织MDA含量(P<0.01)，升高SOD和GSH水平(P<0.01)，提示五味子种籽油可显著改善小鼠肝脏的氧化应激状况，推测其保护作用的机制是通过清除氧自由基实现的。

2.2.2 五味子种籽油对小鼠肝脏病理形态的影响 由图6可知，空白对照组肝组织结构正常，肝小叶结构完整，肝细胞条索排列规则，细胞形态正常，细胞质均匀红染，细胞核清晰，未见明显肿胀变性，枯否氏细胞分布均勾，未见周围大量聚集[图6(a)]。CCl4模型组肝小叶界限模糊，肝细胞索紊乱，肝细胞轮廓模糊，肝上皮细胞细胞核浓缩、溶解，有一些大片状肝细胞坏死灶[图6(b)]。阳性对照组肝细胞形态基本恢复正常[图6(c)]，细胞轮廓较为清晰。低剂量组肝细胞形态较为正常，但仍有部分干细胞轮廓模糊，门管区仍能观测到炎症细胞浸润[图6(d)]；中、高剂量组大多数肝脏结构较CCl4模型组恢复明显，肝小叶结构完整，细胞排列紧密，肝细胞形态基本接近于空白对照组，肝窦恢复正常，肝索呈放射状排列[图6(e)、(f)]。

表4 SOD、MDA、GSH含量测定结果†Table 4 Results of SOD, MDA, GSH content

† a. 与正常对照组相比，差异极显著(P<0.01)；b. 与肝损伤模型组相比，差异显著(P<0.05)；c. 与肝损伤模型组相比，差异极显著(P<0.01)。

3 结论

采用单因素试验及正交试验对五味子种籽油的超声提取工艺进行优化，得最佳提取工艺为：料液比1∶15 (g/mL)、超声功率80 W，提取时间2 h，提取温度50 ℃，验证实验表明工艺稳定，提油率高。HPLC法分析五味子种籽油中木脂素成分的含量，得五味子甲素含量为4.00%，五味子乙素含量为1.95%，五味子醇甲含量为0.13%。保肝试验结果表明，五味子种籽油高、中、低剂量组均可显著降低肝组织MDA含量(P<0.05或P<0.01)，升高SOD和GSH水平(P<0.01)，说明五味子种籽油可显著改善小鼠肝脏的氧化应激状况。HE染色结果显示五味子种籽油可改善小鼠肝细胞水肿、坏死，修复肝损伤。与肝功能相关的血液生化学指标的变化及超声辅助提取工艺的中试放大试验还有待进一步研究。

[1] 彭飞, 林丽, 熊瑞芳. 肝损伤机制的研究[J]. 科技资讯, 2012(33): 236-237.

[2] 隋菱, 郑静彬, 蔡国弟, 等. 姜黄素对四氯化碳诱导大鼠急性肝损害的保护作用[J]. 中国现代应用药学, 2017, 34(11): 1 517-1 521.

[3] 刘宇灵, 付赛, 樊丽姣, 等. 南北五味子化学成分、药理作用等方面差异的研究进展[J]. 中国实验方剂学杂志, 2017, 23(12): 228-234.

[4] 王春梅, 李贺, 李生, 等. 北五味子木脂素对小鼠酒精性肝损伤的保护作用[J]. 食品科学, 2014, 35(13): 262-265.

[5] 孔华丽, 闫亮, 段惠娟. 五味子醇提取物保肝作用成分分析[J]. 解放军药学学报, 2010, 26(1): 27-29, 62.

[6] 白慧媛, 俸珊. 五味子乙素对氯氮平致小鼠肝损伤的保护作用[J]. 药学学报, 2017, 52(3): 390-396.

[7] 刘长姣, 于徊萍, 孟宪梅, 等. 五味子果汁对四氯化碳致大鼠急性肝损伤的保护作用[J]. 食品工业科技, 2014, 35(18): 355-369.

[8] 汪丽君, 刘淑敏, 毛春芹, 等. 一测多评法同时测定五味子中8个木脂素类成分的含量[J]. 药物分析杂志, 2015, 35(7): 1 191-1 197.

[9] 丁传波, 刘群, 董岭, 等. 五味子藤茎中木脂素和多糖对小鼠急性肝损伤的保护作用[J]. 华西药学杂志, 2014, 29(6): 648-650.

[10] 宋影影, 冯婷婷, 李洪发, 等. 五味子籽压榨油中3种木脂素含量的测定及对酒精肝损伤的保护作用研究[J]. 延边大学学报: 自然科学版, 2014, 40(4): 328-331.

[11] 王建花. 高效液相色谱法测定参芪降糖颗粒中五味子甲素、五味子乙素含量[J]. 中国现代药物应用, 2016, 10(18): 289-291.

[12] CHECKER R, PATWARDHAN R S, SHARMA D, et al. Schisandrin B exhibits anti-inflammatory activity through modul-ation of the redox-sensitive transcription factors Nrf2 and NF-kB[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2012, 53(7): 1 421-1 430.

[13] TOORI M A, JOODI B, SADEGHI H, et al. Hepatoprotective activity of aerial parts of Otostegia persica against carbon tetrachlorideinduced liver damage in rats[J]. Avicenna Journal of Phytomed, 2015, 5(3): 238-246.

[14] 王慧竹, 杨英杰, 关铭, 等. 五味子果实、藤茎及藤皮的木质素成分分析[J]. 吉林化工学院学报, 2011, 28(9): 32-34.

[15] 王建青. 内质网应激在四氯化碳诱导小鼠急慢性肝损伤中的作用及部分机制[D]. 合肥: 安徽医科大学, 2012.

[16] 周琼, 刘芳萍, 刘颖姝, 等. 四氯化碳致小鼠急性肝损伤动物模型建立方法的研究[J]. 东北农业大学学报, 2012, 43(6): 77-81.

[17] JUNG J C, LEE Y H, KIM S H, et al. Hepatoprotective effect of licorice, the root of lycyrrhiza uralensis, Fischer, in alcohol-induced fatty liver disease[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2015, 16(1): 1-10.