塑化剂DEHP暴露对小鼠巨噬细胞的免疫毒性作用

韩佳萦，苏伊玲，熊 丽，耿 辉*

（1.华中师大一附中，武汉 430223；2.华中师范大学生命科学学院，武汉 430079）

邻苯二甲酸二－2－乙基己酯（di－2－ethylhexylphthalate，DEHP），又名邻苯二甲酸二异辛酯，是邻苯二甲酸酯类化合物（PAE）的重要成员，是塑料材料中使用量最大的增塑剂，在PVC材料中DEHP含量高达30%～50%[1]。DEHP在塑料中以游离的形式存在，其与塑料成分之间不是以共价化学键结合，而是通过氢键或范德华力相连，因此极容易释放到环境中。据文献报道，DEHP在长江、黄河、珠江、辽河和海河等我国主要水系流域均有高浓度检出。有文献报道重庆市和三峡库区水环境中 DEHP 最高浓度达到 5.421 μg·L－1，对浙江省10个水厂的源水进行抽样分析，发现每个水厂均有邻苯二甲酸酯类检出，其中DEHP最高含量达到 17 μg·L－1[2]。而且 DEHP 很难降解，在环境中存留时间较长，在生物体内具有富集效应，对人体健康和环境安全造成极大的威胁。

DEHP受到广泛的关注还与其多重毒性作用有关。许多动物毒理学研究表明，DEHP具有肝脏毒性、生殖毒性、发育毒性和致癌性等多种毒性，并具有类雌性激素活性[1，3－7]。目前有关 DEHP 对免疫系统作用，特别是介导超敏反应发生已有一些研究。Lee等[8]报道DEHP可诱导CD4+T细胞向Th2型细胞分化并分泌IL－4，IL－4刺激B细胞产生IgE型抗体并通过介导炎症级联反应导致超敏反应。流行病学调查研究证实，职业性接触DEHP的人群发生哮喘的几率大幅增加。Hoppin等[9]报道DEHP及其体内代谢产物邻苯二甲酸单苄酯（Monobenzyl phthalate，MBzP）能够诱导与哮喘、花粉热、关节炎等疾病密切相关的19种特异性IgE抗体的产生，提示DEHP接触与哮喘、花粉热、关节炎等超敏反应及关节炎为代表的自身免疫性疾病的发病有关。DEHP可明显增加人和大鼠免疫细胞膜表面分子CD11b的表达，CD11b专司免疫细胞从血管至炎症部位的迁移与附着，表明DEHP能够影响免疫炎症反应[10]。Kuo等[11]发现DEHP通过抑制MAPKMEK1/2－ERK－ELK1和 NFκB 信号传导途径，抑制髓系DC细胞分泌IFN－α/IFN－β，从而削弱DC细胞对T细胞的辅佐作用，诱导免疫应答反应向Th2方向发展。Eljezi等[3]发现 0.1 μg·L－1浓度剂量的 DEHP 对鼠细胞系L929表现明显的细胞毒性作用。人角膜内皮细胞B4G12体外暴露于DEHP后，炎症相关因子IL－1β、IL－8 和 IL－16的分泌增加，基因表达水平也升高[12]。以上研究提示DEHP暴露可能从多方面影响免疫应答。

由于DEHP在日常用品中的广泛使用，土壤、水体等均已受到不同程度的DEHP污染。DEHP可以通过食品摄入、呼吸空气、饮用水、皮肤吸收等多种途径进入人体。2009年美国CDC开展的第四次针对环境化合物暴露检测报告显示，接受检查的2636例受检者体内都可以检测到DEHP及其代谢产物的存在（www.cdc.gov/exposurereport/pdf/fourthreport.pdf）。 本文选用小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞和腹腔巨噬细胞作为研究材料，通过检测DEHP对巨噬细胞吞噬活性、细胞因子产生、活性氧水平的变化，探讨DEHP暴露对机体免疫系统的毒性作用，为DEHP暴露对免疫系统干扰/毒性风险评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

DEHP购于上海阿拉丁试剂公司（纯度≥98%），DMEM培养基购于Gibco公司，胎牛血清购于杭州四季青公司，Giemsa染色试剂购自南京建成生物公司，TNF－α、IL－12、IL－23 ELISA 检测试剂盒购自三鹰生物，2，7－二氯荧光素二乙酸酯（DCFH－DA）购自江苏凯基生物公司，其他相关试剂均为国产分析纯。二氧化碳培养箱型号为Thermo－BB15，倒置显微镜及照相系统型号为Olympus IX－50，Spectra Max M5多功能酶标仪型号为Molecular Devices－SpectraMax i3x。

1.2 巨噬细胞系RAW264.7细胞培养

巨噬细胞系RAW264.7细胞系华中科技大学基础医学院生物化学教研室惠赠。复苏冻存的RAW264.7细胞方法如下：从液氮罐中取出保存RAW264.7细胞的冻存管，立即将其置于40℃的温水中快速解冻。70%酒精喷洒细胞冻存管消毒，置于超净工作台内，移液器吸取将细胞转移至15 mL离心管中，再补加10倍体积的10%胎牛血清－DMEM培养基，1000 r·min－1离心 8 min，弃上清，重新加入含有10%血清的DMEM完全培养基，轻轻吹打混匀，转移至25 cm2细胞培养瓶，放入37℃、5%CO2培养箱静置培养。定时观察培养基颜色变化及细胞状态，及时更换新鲜培养基，待细胞长满整个培养瓶底部，进行传代培养。

1.3 DEHP处理RAW264.7细胞

将正常RAW264.7细胞接种到培养瓶中，待培养细胞的密度达到80%后进行DEHP暴露。设置1、5、10、20、40、80 mg·L－1DEHP 处理组、0.05%的丙酮溶剂和DMEM完全培养基对照组。DEHP暴露48 h更换正常培养基培养24～48 h，连续细胞传代和贴壁再生长，待培养细胞的密度达到80%后进行DEHP暴露，如此重复10代。染毒DEHP暴露10代后收获细胞，用于红细胞吞噬实验、细胞因子分泌、活性氧水平检测。巨噬存活率经0.04%台盼蓝染色确定细胞存活。

1.4 腹腔巨噬细胞分离培养

BALB/c小鼠购于湖北省疾病预防医学科学院。小鼠暴露浓度设计依据体外实验结果确定。选取30只8～12周龄雄性健康BALB/c小鼠随机分成5组，分别设置为 1、5、10 mg·L－1DEHP 处理组、0.05%的丙酮溶剂和蒸馏水对照组，采用自由饮水方式喂饲小鼠，连续饲养20周后颈椎脱臼处死小鼠，75%酒精浸泡5 min，剪开腹下部皮肤打开腹腔，用吸管吸取PBS反复冲洗腹腔，收集腹腔渗出液，1000 r·min－1离心 8 min，弃上清，PBS洗涤2遍。用10%胎牛血清－DMEM培养基调节细胞浓度至5×106细胞·mL－1，接种于24孔板中，每孔2 mL，置37℃、5%CO2培养箱培养，每2 h定时取出培养板于倒置显微镜下观察巨噬细胞贴壁情况。

1.5 红细胞吞噬实验

向培养有巨噬细胞的培养板中按1∶50比率加入绵羊红细胞，放回CO2培养箱中孵育，3 h后取出培养板，PBS反复冲洗未被巨噬细胞吞噬的红细胞，自然干燥后加入冷丙酮溶液固定5 min。滴加Giemsa染液10 min，自来水冲干净，在显微镜下观察计数吞噬百分率和吞噬指数。

吞噬百分率=吞噬红细胞的巨噬细胞/100个巨噬细胞×100%

吞噬指数=被吞噬的红细胞/100个巨噬细胞

1.6 ELISA 检测 TNF－α、IL－12、IL－23 细胞因子表达

将经过DEHP处理的RAW264.7细胞浓度调至1×107·mL－1，培养于 24 孔板中，每孔加入 1 mL 细胞悬液和 2×10－3μg·L－1LPS 刺激（每种剂量浓度 DEHP 均设3个重复孔），培养72 h后，吸取培养上清液用于细胞因子的测定。以双抗体夹心ELISA法，测定培养上清液中 TNF－α、IL－12、IL－23 细胞因子浓度。操作步骤按三鹰生物公司提供的检测试剂盒中说明书进行。

1.7 活性氧（ROS）水平检测

将经过DEHP连续处理10代的RAW264.7细胞浓度调至 1×107·mL－1，接种于 24 孔板，加入 2×10－3μg·L－1LPS刺激2 h后，按照凯基活性氧检测试剂盒的操作说明，采用对ROS敏感的荧光探针DCFH－DA标记细胞，利用荧光酶标仪在488nm激发波长、525nm发射波长下测定不同细胞样品中DCF的荧光值，检测DEHP不同浓度处理组细胞内活性氧的变化。

1.8 统计学处理

应用GraphPad Prism 5统计软件进行单因素方差分析（One－Way ANOVA），实验数据以 X±SD 表示，两组间计量资料的比较采用t检验。P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 DEHP对RAW264.7细胞的毒性作用

为评估DEHP暴露对巨噬细胞的毒性作用，首先用不同浓度剂量的 DEHP（1、5、10、20、40、80 mg·L－1）处理巨噬细胞株RAW264.7细胞。RAW264.7细胞暴露于 1、5、10 mg·L－1DEHP 48 h 后，未发现细胞活力状态及死亡细胞数目发生变化（图1）。然而经20、40、80 mg·L－1DEHP 处理后，RAW264.7 细胞的活力状态变弱，死亡细胞的数目显著增加（图2）。

2.2 DEHP对RAW264.7细胞吞噬能力的影响

鉴于动物与人体接触环境中DEHP的实际情况是低剂量长时间暴露，我们采用 1、5、10 mg·L－1浓度剂量的DEHP对巨噬细胞株RAW264.7进行持续染毒。经连续染毒处理10代后，RAW264.7细胞的活力、形态以及繁殖传代时间未见显著变化（结果未显示）。细胞吞噬功能测定显示，向DMEM完全培养基和丙酮对照组RAW264.7细胞中加入绵羊红细胞2 h后，可观察到巨噬细胞吞噬红细胞，被吞噬红细胞及巨噬细胞形态轮廓清晰可辨，被吞噬红细胞数目从一个到多个不等，有部分红细胞粘附在巨噬细胞外围将要被吞噬（图3）。而经DEHP连续处理10代后，RAW264.7细胞的吞噬红细胞能力显著减弱（图3）。每组实验重复3次，统计结果显示DMEM完全培养基与丙酮对照组相比，吞噬百分率和吞噬指数无统计学差异（表 1），而 1、5、10 mg·L－1DEHP 各暴露组与丙酮对照组相比，吞噬百分率和吞噬指数均呈现显著下降趋势（P＜0.05）。

图2 RAW264.7细胞接受不同浓度剂量DEHP处理后的死亡率（n=3）Figure 2 The mortality of RAW264.7 cells by treated with different dosages of DEHP（n=3）

图1 不同浓度剂量DEHP处理RAW264.7细胞48 h后的镜检结果（放大倍数：×200）Figure 1 Microscopic images of RAW264.7 cells treated with different dosages of DEHP after 48 h treatment（Magnification：×200）

图3 RAW264.7细胞吞噬红细胞镜检结果（放大倍数：×400）Figure 3 Microscopic examination of phagocytosis efficiency with RAW264.7 cell（Magnification：×400）

2.3 DEHP 对 RAW264.7细胞分泌 TNF－α、IL－12、IL－23细胞因子的影响

1、5、10 mg·L－1DEHP 连续处理 10 代后，换用正常培养基继续培养24～48 h，再接受LPS刺激72 h后收集细胞上清液，TNF－α、IL－12、IL－23 的变化趋势见图 4。由图 4 可以看出，经 1、5、10 mg·L－1的 DEHP 连续处理后，RAW264.7 细胞分泌 TNF－α、IL－12、IL－23等细胞因子的能力较丙酮对照组比较显著降低。并且TNF－α、IL－12、IL－23 下降趋势与 DEHP 暴露浓度呈现剂量－效应关系，提示DEHP能抑制RAW264.7细胞分泌 TNF－α、IL－12、IL－23等细胞因子。

表1 不同剂量DEHP暴露对RAW264.7细胞吞噬活性的影响Table 1 Effects of different dose DEHP exposure on phagocytosis of RAW264.7

图4 DEHP暴露对RAW264.7细胞因子分泌的影响（OD：光密度，n=3，*P＜0.05）Figure 4 Effects of different dosages of DEHP on cytokines secretion of RAW264.7（OD：Optical density，n=3，*P＜0.05）

2.4 DEHP对RAW264.7细胞ROS产生的影响

1、5、10 mg·L－1DEHP 连续处理 10 代后，换用正常培养基继续培养 48 h，加入 2×10－3μg·L－1LPS 刺激2 h后，用DCFH－DA荧光探针标记RAW264.7细胞，测定细胞内荧光强度以反映ROS的产生量。图5显示，经 1、5、10 mg·L－1浓度剂量的 DEHP 连续染毒后，RAW264.7细胞内的ROS水平与丙酮对照组相比显著下降，随着DEHP浓度的加大，DEHP对RAW264.7细胞ROS水平的抑制作用逐渐增强，当DEHP浓度达到10 mg·L－1时，细胞内ROS水平降至对照组水平的34.69%。

2.5 DEHP对腹腔巨噬细胞贴壁及吞噬能力的影响

为进一步验证DEHP对巨噬细胞免疫功能的影响，我们还选用了小鼠腹腔巨噬细胞作为研究材料。采用 1、5、10 mg·L－1DEHP 喂饲小鼠，连续饲养 20 周后收集小鼠腹腔巨噬细胞，隔2 h于倒置显微镜下观察巨噬细胞粘附贴壁情况及形态变化。对照组腹腔巨噬细胞于体外培养2 h后逐渐伸展增大，4 h后能粘附到24孔培养板上，形状呈梭形或不规则形并有伪足或突起伸出。而各剂量浓度DEHP对巨噬细胞黏附伸展能力均有一定的影响，其中5、10 mg·L－1DEHP暴露组巨噬细胞黏附伸展能力下降显著，分别需要12、14 h才能完全贴壁。红细胞吞噬实验显示，各剂量浓度DEHP暴露与丙酮对照组相比，巨噬细胞吞噬红细胞数目、吞噬百分率及吞噬指数均显著降低（表2）。

3 讨论

DEHP是日常生活中使用和接触最多的增塑剂，DEHP可不断地从塑料中释放。从近年来我国各大水系的检测结果来看，水环境中DEHP的含量已经超出我国水环境中允许的浓度范围[13]。由于DEHP具有较高的脂－水分配系数，可被土壤吸附并且可被生物富集，因此生物体中DEHP的含量要远高于水体和土壤[14]。

表2 不同剂量DEHP暴露对小鼠腹腔巨嗜细胞吞噬活性的影响Table 2 Effects of different dose DEHP exposure on phagocytosis of murine peritoneal macrophages

图5 DEHP对RAW264.7细胞ROS产生的影响（n=3，重复检测次数：2 次，*P＜0.05）Figure 5 DEHP inhibited ROS production in RAW264.7 cells（n=3，Repeated detection times：2，*P＜0.05）

自1981年首次报道DEHP诱发啮齿类动物肿瘤以来，关于DEHP毒性研究的文献日渐增多。巨噬细胞是机体内重要的免疫效应细胞，具有多种免疫功能，包括免疫防御、免疫监视、免疫调节以及抗原呈递等，在机体的免疫系统中起着重要作用[15]。由于巨噬细胞株RAW264.7细胞已经成功建系，易于体外传代培养，因此本研究首先选用RAW264.7细胞作为研究对象，探讨DEHP对巨噬细胞功能的影响。结果显示，虽然较低浓度剂量（1、5、10 mg·L－1）DEHP 暴露并没有急性毒性作用，然而经连续10代持续暴露后，DEHP对细胞株RAW264.7吞噬功能有明显抑制作用。接受外来抗原刺激后分泌细胞因子（如TNF－α、IL－12、IL－23）是巨噬细胞应答的基本反应[16]。本研究证实，DEHP对RAW264.7细胞接受LPS刺激后分泌TNF－α、IL－12、IL－23 等细胞因子有明显的抑制作用，且呈一定的剂量－效应关系。细胞内ROS水平也是反映巨噬细胞功能的指标之一[17]。吞噬细胞受到刺激时通过呼吸暴发机制，产生大量ROS，ROS是吞噬细胞发挥吞噬和杀伤作用的主要介质。在机体免疫防御过程中，巨噬细胞通过产生一定量的ROS，破坏细菌的细胞膜和病毒的蛋白质，从而消灭外来病原微生物。本研究发现，DEHP连续处理巨噬细胞株RAW264.7后，再接受LPS刺激2 h后，用DCFH－DA荧光探针法检测ROS的产生，显示细胞ROS的产生受到抑制，并且随着DEHP浓度的增大，细胞内ROS水平下降愈加明显。这些结果说明DEHP对巨噬细胞正常功能发挥具有显著的抑制作用。

由于腹腔巨嗜细胞游离存在于腹腔的腹水中，易于获得，因此本研究还选用腹腔巨噬细胞作为研究对象。结果表明DEHP对腹腔巨噬细胞粘附贴壁及吞噬能力均有显著抑制作用。粘附贴壁能力反应巨噬细胞的活力状态，吞噬能力是反映其免疫防御能力的一个重要指标[18]，DEHP抑制腹腔巨噬细胞的粘附贴壁及吞噬能力，表明DEHP可影响巨噬细胞的免疫防御功能，从而对机体的免疫能力产生抑制作用。

4 结论

（1）高浓度（20、40 和 80 mg·L－1）DEHP 暴露可对巨噬细胞株RAW264.7细胞造成急性损伤。

（2）低浓度（1、5、10 mg·L－1）DEHP 长时间暴露对RAW264.7和腹腔巨噬细胞有免疫毒性作用。

（3）本研究评估了DEHP对巨噬细胞的免疫毒性作用，这对全面了解DEHP的毒性具有十分重要的意义，研究结果可为DEHP的免疫毒性风险评估提供一定的科学依据。

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