大鼠灌胃黄独素B单体和黄药子醇提物后黄独素B的药动学和组织分布比较

许玉凤，阳海鹰，原 梅，李 桦

（军事医学研究院毒物药物研究所，抗毒药物和毒理学国家重点实验室，北京 100850）

黄药子（黄独，Dioscorea bulbiferaL.）是薯蓣科植物黄独的地下块茎。黄药子在中国已有上千年的药用历史，具有多种生物活性［1］。1963年《中国药典》记载，其性味苦、平，具有凉血、降火、消瘿和解毒等功能。现代药理学研究表明，黄药子具有抗病毒、抗肿瘤、抗炎、抗菌和治疗甲状腺肿等作用［2］。临床常见的黄药子制剂有白蚀丸和增生平片等。长期服用黄药子会导致严重的肝损伤［3］，由此引起用药安全性的关注。已有研究表明，黄独素B（diosbulbin B，DIOB）是黄药子发挥抗肿瘤和抗炎活性的药效成分，也是导致肝毒性的毒效成分［4-5］。DIOB结构中的呋喃环在肝经代谢酶作用，代谢活化生成反应性产物，与蛋白质等大分子结合，产生肝毒性［6-8］。

黄药子的肝毒性与其代谢性质密切相关。DIOB在大鼠和小鼠的药动学研究已有报道［9-11］。目前，临床上常以黄药子煎剂或黄药子复方制剂形式给药，而DIOB尚未成药。以黄药子或黄药子醇提物（ethanol extract fromD.bulbiferaL.，EEDB）给药的血浆药动学及靶组织分布尚无报道。为此，本研究采用液相-串联质谱法（liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS），比较研究EEDB和DIOB单体ig给药后DIOB在大鼠体内的代谢差异，为黄药子毒理学研究和临床合理用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂

DIOB购自成都曼斯特生物科技有限公司（批号MUST-15031805），纯度为95.11%；黄药子药材购于北京同仁堂药店，经鉴定为薯蓣科薯蓣属黄药子。盐酸普萘洛尔购于美国Sigma（批号BCBB9359V），纯度≥98%；甲醇和乙腈（色谱纯），美国Fisher公司；甲酸，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.2 仪器和设备

美国Aligent 6410B三重四级杆串联质谱，配备Agilent1290超高液相色谱仪（UHPLC），电喷雾离子化电源和MassHunterB.04.00数据处理系统；微量台式离心机Fresco 21购于美国Thermo公司；小型台式恒温摇床MaxQ 4450购自美国Thermo Scientific公司。

1.3 实验动物

雄性SD大鼠，SPF级，体质量180～220 g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK（京）2016-0006。

1.4 黄药子醇提物的制备

黄药子打碎成粗粉，加6倍体积75%乙醇浸泡30 min后，加热回流提取2 h，倒出药液，残渣再以6倍体积75%乙醇重复回流提取3次。合并提取液，减压浓缩至浸膏，-80oC保存。经LC-MS/MS方法分析，EEDB中DIOB的含量为0.13%。

1.5 LC-MS/MS定量分析

色谱条件：CAPCELLPAKC18色谱柱（2.0mm×50mm，3μm），流动相A为含5mmol·L-1甲酸铵和0.1%甲酸的水，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈。DIOB梯度洗脱程序：0～0.5min，10%B；0.5～2.0min，10%～60%；2.0～2.5 min，60%～ 90%；2.5～2.7 min，90%～10%。

流速：0.3 mL·min-1；柱温25oC；进样体积5 μL。

质谱条件：采用ESI源正离子检测，扫描方式为多反应监测；质谱分析参数：毛细管电压4000 V，毛细管温度320oC，雾化电压35 psi，干燥气流速11 L·min-1。DIOB检测离子对m/z 362→317，裂解电压112 V，碰撞电压16 V。

1.6 方法学验证

考察血浆样品中DIOB在1～1000 μg·L-1浓度范围内的线性范围和最低定量限（lower limit of quantification，LLOQ）。配制2，50和800 μg·L-1质控血浆样品，考察DIOB在LLOQ和上述质控浓度水平的精密度和准确度，以及3个质控浓度的提取回收率和基质效应，测定在室温或4oC放置24 h，-20oC放置30 d和反复冻融（-20～4oC）条件下的稳定性。在血浆样品方法学全面验证的基础上，对组织样品进行线性、提取回收率和基质效应等的验证。

1.7 药动学实验

取SD大鼠10只，随机分为DIOB单体组和EEDB组，分别ig给予EEDB 1.0 g·kg-1或DIOB 1.3 mg·kg-1（与EEDB中DIOB等量），于2，5，15和30 min及1，2，4，8，12和24 h眼眶取血，肝素抗凝，5000×g，4oC离心10 min，分离血浆待测。

1.8 组织分布测定

取SD大鼠60只，随机分为DIOB单体组和EEDB组，分别ig给予DIOB 1.3 mg·kg-1或EEDB 1.0 g·kg-1。给药前禁食12 h，自由饮水。于给药后0.17，0.5，2，6，12和 24 h处死大鼠，每时间点5只。大鼠股动脉取血，并摘取心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉和脂肪等器官和组织。器官组织用预冷的蒸馏水冲洗，吸干多余水分后称重，用蒸馏水以1∶4的比例制成组织匀浆，取50 μL血浆或组织匀浆，加入150 μL内标工作液（含普萘洛尔100 μg·L-1的乙腈溶液），涡旋振荡1 min，18 800×g，4oC离心10 min，取上清5 μL进样至LC-MS/MS分析。

1.9 蛋白结合率测定

采用快速平衡透析法（rapid equilibrium dialysis，RED）［12］测定DIOB在血浆和组织（肝、肺）的蛋白结合率。肝和肺组织加蒸馏水制备1∶4的匀浆，根据DIOB给药后的血浆和组织峰浓度，取大鼠血浆和组织匀浆制备浓度为200或1000 μg·L-1的DIOB含药样品，并以普萘洛尔（200 和1000 μg·L-1）为阳性对照，测定蛋白结合率。将DIOB 200 μL或普萘洛尔样品加入样品室，PBS缓冲液350 μL加入缓冲液室。密封、置37°C恒温摇床，100 rpm振摇孵育4 h。透析结束后，从样品室和缓冲液室分别取50 μL样品置于离心管中，并分别补加50 μL不含药的PBS缓冲液和肝、肺空白组织匀浆，加入沉淀剂涡旋振荡2 min，18 800×g，4°C 离心10 min，取5 μL上清液进样分析。

1.10 数据处理

应用公式①和②分别计算DIOB在大鼠血浆和组织匀浆的游离分数（ƒu），应用公式③进行稀释倍数的校正，计算组织的游离分数（ƒu，组织）［13］。式中，D代表组织的稀释倍数。应用公式④和⑤分别计算血浆和组织中DIOB的游离浓度。

采用 WinNonLin 6.4（Pharsight Inc，USA）软件的非房室模型分析，得到药动学参数。实验结果数据以表示，用SPSS 20进行成组t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LC-MS/MS方法学建立及验证

应用本研究确定的LC-MS/MS分析条件，DIOB与内标普萘洛尔分离度良好，生物样品中内源性物质对DIOB的测定没有干扰（图1），方法专属性好。在1～1000 μg·L-1浓度范围内DIOB呈良好线性关系（r2＞0.99），LLOQ为1.0 μg·L-1。

在LLOQ和2，50和800 μg·L-13个质控浓度水平，血浆和组织样品中DIOB的定量检测批内和批间精密度相对标准差（relative standard deviation，RSD）＜15%，准确度相对误差（relative error，RE）为-10.3%～14.9%。DIOB在血浆和组织样品的提取回收率为96.6%～112.2%，基质效应在88.8%～99.2%范围内。稀释线性RE为-6.5%～13.8%，RSD＜9.1%。质控样品浓度在室温、4oC进样仓、-20oC放置30 d和-20oC反复冻融的条件下稳定性良好（RSD＜10.7%），建立的方法能满足本研究的需要。

Fig.1 Representative multiple reaction monitoring chromatograms of diosbulbin B（DIOB）in plasma of rats.A：blank plasma；B：DIOB；C：propranolol hydrochloride；D：blank plasma spiked with lower limit of quantification（propran⁃olol hydrochloride 100 μg·L-1and DIOB 1.0 μg·L-1）；E：plasma sample taken at 2 h from DIOB 1.3 mg·kg-1dosed rats（propranolol hydrochloride 100 μg·L-1and DIOB 19.6 μg·L-1）.1：DIOB；2：propranolol hydrochloride.

2.2 大鼠血浆药动学

大鼠分别ig给予等剂量DIOB的EEDB1.0g·kg-1和DIOB单体1.3 mg·kg-1，定时采集血样，得到DIOB的药时曲线（图2）和药动学参数（表1）。2个给药组的DIOB在大鼠体内的吸收和消除均较快，给药后2 min即可在血浆中检测到DIOB，12 h的血浆浓度低于定量下限。EEDB组的DIOB血药浓度在（0.23±0.17）h 达峰，cmax为（131±67）μg·L-1，AUC（0-8h）为（189±70）μg·h·L-1。DIOB单体组的DIOB血药浓度在（0.12±0.07）h达峰，cmax为（312±67）μg·L-1，显著高于EEDB组（P＜0.01）；尽管DIOB单体组的AUC值＞EEDB组的AUC值，但二者之间无统计学差异。比较2个给药组的DIOB消除可见，DIOB单体组的末端消除半衰期t1/2为（1.17±0.28）h，显著快于EEDB组的（2.34±0.83）h（P＜0.05）；同样，2组的平均滞留时间MRT也有显著差异（P＜0.05）。结果表明，大鼠DIOB单体和EEDB给药后的药动学存在一定的差异，主要表现为血浆峰值和消除的差异。

Fig.2 Plasma concentration-time profiles of DIOB in rats after ig administration of compound DIOB and ethanol extract of Dioscorea bulbifera L.（EEDB）,respec⁃tively.After a single ig administration of DIOB 1.3 mg·kg-1or EEDB 1.0 g·kg-1，blood samples were collected，and the plasma concentrations of DIOB were measured by a validated LC-MS/MS method

Tab.1 Pharmacokinetic parameters of DIOB in rats after ig administration of DIOB and EEDB

2.3 组织分布

分别ig给予大鼠等剂量DIOB的EEDB和DIOB单体，不同时间点测定DIOB的血浆和心、肝、脾和肺等组织分布浓度，得到组织浓度峰值cmax和AUC等参数。表2和图3结果表明，EEDB和DIOB单体给药后，DIOB可快速至各组织。DIOB单体组各组织的浓度在0.17 h达到峰值，0.5 h的浓度显著降低；除肺组织外，其他组织DIOB浓度在2 h降低至定量限。DIOB单体组DIOB在各组织中的暴露量AUC（0-24h）由高到低依次为肺＞肝＞血浆＞肾＞脾＞心＞肌肉＞脂肪＞脑。肺的分布浓度（4527.0±557.7）ng·h·g-1显著高于其他组织，其次是肝和肾组织183.0±51.1和（64.4±22.4）ng·h·g-1。EEDB组DIOB组织分布模式与DIOB单体组相似，DIOB很快进入组织；除肺组织，大多数组织DIOB消除较快。EEDB组DIOB的AUC（0-24h）由高到低排序为肺＞肝＞肾＞脾＞血浆＞心＞肌肉＞脂肪＞脑，肺、肝和肾的暴露量AUC分别为6507.9±424.3，（467.5±202.7）和（238.6±70.0）ng·h·g-1，均显著高于DIOB单体组（P＜0.05，P＜0.01）。2个给药组DIOB在肺组织不仅分布高，且消除较慢，给药24 h时肺浓度才降低至峰浓度的1/10。

Tab.2 Tissue distribution of DIOB in rats after ig administration of DIOB and EEDB.

Fig.3 Tissue dynamic distribution of DIOB in rats after ig administration of DIOB（A）and EEDB（B）.See Fig.2 for the rat treatment.After administration of DIOB and EEDB，tissue samples were collected at 0.17，0.5，2，6，12 and 24 h.The samples were measured by LC-MS/MS.The unit in plasma sample was μg·L-1.

2.4 DIOB的蛋白结合率和组织/血浆浓度比

为了排除非特异性蛋白结合对DIOB组织分布浓度的影响，采用RED法测定DIOB在血浆、肝和肺组织的蛋白结合率。阳性药普萘洛尔在200和1000 μg·L-1时，其血浆蛋白结合率分别为82.5%和84.8%，与文献报道（87%）一致［14］。DIOB在200和1000 μg·L-1时，其血浆蛋白结合率分别为38.7%和43.6%，在肝组织的蛋白结合率分别为61.3%和66.9%，在肺组织的蛋白结合率分别为61.4%和64.7%；在肝和肺组织的蛋白结合率高于血浆，且在测定的2个药物浓度之间无显著差异。DIOB在血浆、肝和肺组织的游离分数（ƒu）见表3。由ƒu计算得到DIOB在血浆、肝和肺组织的游离浓度，并计算游离浓度AUC的组织/血浆比值Kp，AUC，ƒu。DIOB在肝和肺组织的游离浓度仍高于血浆（图4）。DIOB单体组 DIOB 在肝和肺组织的Kp，AUC，ƒu为 1.9±0.4 和55.0±19.9，EEDB组为2.1±0.3和48.0±5.4，提示DIOB在存在肺组织特异性分布。

Tab.3 Unbound fractions for DIOB in rat plasma，liver and lung tissues

Fig.4 Unbound plasma and tissues concentrations of DIOB in rats after ig administration of DIOB（A）and EEDB（B）.See Fig.3 for the rat treatment.Unbound plasma and tissues concentrations of DIOB were calculated with unbound cPlasma=cPlasma׃u，Plasmaand unbound cTissue=cTissue׃u，Tissue.The unit of plasma sample was μg·L-1.

3 讨论

大鼠血浆药动学研究发现，DIOB单体和EEDB给药后，DIOB在大鼠体内的血浆动力学存在一定的差异，单体组DIOB吸收入血快，cmax是EEDB组的2.4倍，消除也显著快于EEDB。提示黄药子药效中的其他成分可能减慢DIOB吸收进入血循环、以及从血循环消除的过程。在研究黄药子肝毒性时，应考虑不同给药对象因药动学行为差异导致的毒性差异。

文献报道，DIOB主要经代谢活化产生肝毒性［15］。因此，DIOB单体和黄药子中DIOB的靶器官分布对研究黄药子的毒性至关重要。本研究发现，无论是以DIOB单体还是以EEDB的形式给药，DIOB均可快速进入组织，且在大部分组织中的消除较快。2个给药组DIOB在毒性靶器官肝的整体暴露水平仅次于肺，显著高于其他组织。DIOB单体组肝峰值浓度高于肺，EEDB组DIOB在肝分布峰值浓度较低，消除也较慢。经游离分数校正得到的肝/血游离浓度比值Kp，AUC，ƒu仍接近或＞2，表明肝是DIOB的分布靶器官之一，DIOB在肝组织的高暴露水平与其肝毒性相关。

本研究发现，DIOB在肺组织有很高的分布，且消除显著慢于其他组织，其肺/血游离浓度的AUC比值为48～55，在肺的游离浓度远高于血浆，具有特异性分布的特征。比较2个给药组，EEDB组DIOB在肺的AUC显著高于DIOB单体组。黄药子在临床上可用于治疗慢性气管炎、百日咳和小儿顽固性哮喘等，肺是DIOB的药效靶器官之一，其在肺组织的分布特征可能有助于药效的发挥。目前，尚未见黄药子或DIOB肺毒性报道。黄药子和DIOB的肺器官药效学和毒理学值得进一步研究。

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