谷氨酰胺联合吉西他滨对人肺腺癌A549细胞增殖、凋亡及XIAP表达的影响

饶显浪，邓述恺（西南医科大学附属第一医院呼吸内一科，四川泸州646000）

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，腺癌是其最主要的组织学类型，吉西他滨主要用于非小细胞肺癌一线化疗及维持治疗用药。近年来，相关研究表明，谷氨酰胺具有一定的抗肿瘤作用，谷氨酰胺联合化疗可增强化疗药物对肿瘤细胞的作用。有研究表明，X⁃连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）在多种恶性肿瘤细胞中高表达，具有抑制肿瘤细胞凋亡、降低肿瘤细胞对化疗药物敏感性的作用[1]。本研究探讨了体外谷氨酰胺联合吉西他滨对人肺腺癌A549细胞增殖、凋亡及对XIAP表达的影响，旨在为肺癌化疗提供更有效的方案及理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人肺腺癌A549细胞株为西南医科大学附属第一医院肿瘤科赠送，吉西他滨购自江苏豪森药业股份有限公司（批号：150804），谷氨酰胺、胚牛血清、胰酶、CCK⁃8试剂盒均购自中国碧云天生物技术有限公司，达尔伯克孜良伊格尔哈姆F⁃12培养基（DMEM/F⁃12）购自吉诺生物医药技术有限公司，膜联蛋白 V⁃异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V⁃FITC/PI）细胞凋亡检测试剂盒购自天津三箭生物技术有限公司，XIAP试剂盒购自深圳子科生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抑制浓度选取 吉西他滨浓度根据前期预实验结果及查阅文献[1⁃2]得到人非小细胞肺癌的半数抑制浓度为0.01 mg/L，选取半数抑制浓度作为实验浓度。谷氨酰胺浓度根据前期实验结果选取最佳抑制浓度32 mmol/L为实验浓度。

1.2.2 细胞培养及分组 用含10%胚牛血清、100μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM/F⁃12培养液培养人肺腺癌A549细胞，置于含5%二氧化碳、37℃细胞培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。设置空白对照组（无药物干预）、吉西他滨组（0.01 mg/L）、谷氨酰胺组（32 mmol/L）、联合用药组[谷氨酰胺（32 mmol/L）联合吉西他滨（0.01 mg/L）]，分别培养 24、48、72 h 进行实验。

1.2.3 CCK⁃8法检测细胞增殖抑制率 取对数生长期的人肺腺癌A549细胞，按每孔1×104个细胞接种到96孔板，每孔加100 μL，贴壁后按实验分组进行处理，分别加入吉西他滨（0.01 mg/L）、谷氨酰胺（32 mmol/L）及吉西他滨（0.01 mg/L）联合谷氨酰胺（32 mmol/L）作用24、48、72 h，每组重复 5 孔，同时，设置对照组。各孔加入CCK⁃8试剂盒试剂0.01 mL，继续培养4 h后使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度值，实验重复3次。按公式测定药物对细胞的增殖抑制率。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 Annexin V⁃FITC/PI双染后应用流式细胞仪检测细胞凋亡。取对数生长期A549细胞按实验分组进行干预，培养72 h后用胰蛋白酶消化，1 000 r/min离心5 min。用磷酸盐缓冲液清洗2次后，用300 μL的结合缓冲液重悬。加入5 μL Annexin V⁃FITC，混匀后避光孵育 10 min，加入碘化丙啶 5 μL，混匀后避光孵育5 min，1 h内采用流式细胞仪测定结果。实验重复3次。

1.2.5 酶联免疫吸附试验检测A549细胞中XIAP的表达 取对数生长期A549细胞按实验分组进行干预，培养72 h后收集上清液备用。设置标准品孔和样本孔，标准品孔分别加入 0、25、50、100、200、400 pg/mL 标准品各50 μL；样本孔先加待测样本10 μL，再加样本稀释液40 μL，空白孔不加。标准品孔和样品孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100 μL，封板后37℃孵育60 min，弃上清液，洗板 5 次；每孔加底物 A、B 各 50 μL，37℃避光孵育15 min，加入终止液50 μL，15 min内在450 nm波长处测定各孔吸光度值。根据标准曲线计算XIAP终浓度。

1.3 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组组间、组内比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组人肺腺癌A549细胞不同时间点增殖抑制率比较 谷氨酰胺组、吉西他滨组及联合用药组人肺腺癌A549细胞不同时间点增殖抑制率均明显高于空白对照组，且随作用时间的延长抑制作用逐渐增强，差异均有统计学意义（P＜0.05）；联合用药组人肺腺癌A549细胞不同时间点增殖抑制率均明显高于其他各组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 1、图 1。

表1 各组人肺腺癌A549细胞不同时间点增殖抑制率比较（±s，%）

表1 各组人肺腺癌A549细胞不同时间点增殖抑制率比较（±s，%）

注：与空白对照组同时间点比较，aP＜0.05；与同组前一时间点比较，bP＜0.05；与谷氨酰胺组同时间点比较，cP＜0.05；与吉西他滨组同时间点比较，dP＜0.05

组别空白对照组吉西他滨组谷氨酰胺组联合用药组24 h 0.000±0.000 34.693±2.075a 28.773±0.468a 54.690±1.510acd 48 h 0.000±0.000 51.806±1.018ab 48.803±0.801ab 71.780±0.318abcd 72 h 0.000±0.000 69.961±0.697ab 66.888±0.376ab 79.664±0.749abcd

图1 不同时间点对人肺腺癌A549细胞增殖抑制率的影响

2.2 各组人肺腺癌A549细胞作用72 h后凋亡率比较空白对照组人肺腺癌A549细胞作用72 h后凋亡率为（2.9±0.8）%，吉西他滨组为（53.6±2.0）%，谷氨酰胺组为（37.6±1.7）%，联合用药组为（60.0±0.4）%。与空白对照组比较，吉西他滨组、谷氨酰胺组、联合用药组人肺腺癌A549细胞作用72 h后凋亡率均明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；联合用药组人肺腺癌A549细胞作用72 h后凋亡率明显高于吉西他滨组、谷氨酰胺组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图 2、3。

图2 各组人肺腺癌A549细胞作用72 h后凋亡率比较

图3 各组人肺腺癌A549细胞作用72 h后细胞凋亡图

2.3 各组人肺腺癌A549细胞XIAP表达比较 空白对照组人肺腺癌A549细胞XIAP表达水平为（217.131±7.105）pg/mL，吉西他滨组为（276.972±10.505）pg/mL，谷氨酰胺组为（116.267±8.268）pg/mL，联合用药组为（163.448±5.517）pg/mL。与空白对照组比较，吉西他滨组人肺腺癌A549细胞XIAP表达明显升高，谷氨酰胺组、联合用药组人肺腺癌A549细胞XIAP表达均明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

图4 各组人肺腺癌A549细胞XIAP表达比较

3 讨 论

肺癌在世界范围内发病率和病死率均居癌症首位，尤以非小细胞肺癌居多，其中腺癌是肺癌最主要的组织学类型。目前，化疗仍是肺癌的主要治疗方法之一。

吉西他滨属细胞周期特异性抗代谢药物，主要作用于DNA合成期，其特点为抗瘤谱广、不良反应少，1996年美国食品药品监督管理局正式批准吉西他滨作为非小细胞肺癌的一线化疗药物[3]。但目前肺癌对吉西他滨存在一定普遍耐药情况，其临床应用受到一定限制。吉西他滨在体内代谢过程复杂，涉及多种蛋白和因子的参与，其耐药性的产生也是由多因素共同作用的结果[4]。因此，寻找有效的药物增强非小细胞肺癌对吉西他滨的敏感性及增强化疗疗效尤为重要。

谷氨酰胺是一种条件必需氨基酸，是包括肿瘤细胞在内的快速生长细胞的主要能源物质。但近年来不少研究表明，谷氨酰胺具有一定的抗肿瘤作用。MAR⁃TINS等[5]发现，荷瘤小鼠补充谷氨酰胺可抑制肿瘤细胞生长，减轻恶病质，在FRACARO等[6]的研究中也得到证实。有研究发现，在胰腺导管腺癌细胞中补充谷氨酰胺可抑制肿瘤细胞生长[7]。TODOROVA等[8]发现，荷瘤动物经肠补充谷氨酰胺可诱导细胞凋亡，进一步的研究发现，谷氨酰胺可下调β细胞淋巴瘤/白血病基因⁃2表达水平，同时，上调β细胞淋巴瘤/白血病基因⁃2相关蛋白 X、凋亡蛋白酶⁃3（Caspase⁃3）表达水平，从而抑制肿瘤细胞增殖。

本研究结果显示，谷氨酰胺组人肺腺癌A549细胞增殖抑制率明显高于空白对照组，且随作用时间的延长抑制作用也增强；谷氨酰胺组人肺腺癌A549细胞凋亡率也明显高于空白对照组，提示谷氨酰胺能抑制A549细胞增殖，促进A549细胞凋亡。

XIAP是IAPs的成员之一，是凋亡抑制蛋白家族中唯一能直接抑制凋亡蛋白酶的凋亡抑制蛋白，能同时抑制起始阶段及效应阶段的凋亡蛋白酶，通过抑制启动性Caspase⁃9在上游阻止Caspase⁃3的激活，通过抑制效应性Caspase⁃3和Caspase⁃7而阻止凋亡通路下游途径，对凋亡蛋白酶诱发的外源性及内源性细胞凋亡过程具有明显的抑制作用，是作用极强的凋亡抑制剂[9⁃10]。XIAP在许多肿瘤中高表达，包括非小细胞肺癌，且肿瘤的病理分期越晚，组织学分化越差，术后复发率越高，XIAP 表达量越高[11⁃12]。XIAP 参与了化疗耐药，相关的体内、外实验结果显示，下调XIAP表达能增加肿瘤细胞对化疗诱导凋亡的敏感性[13]。

近年来，不少研究报道了吉西他滨能上调胰腺癌中XIAP的表达，导致肿瘤细胞对吉西他滨的敏感性降低[14⁃15]。因此，作者猜想，吉西他滨能上调肺癌XIAP的表达，谷氨酰胺能下调XIAP的表达。本研究结果显示，吉西他滨能上调XIAP的表达，谷氨酰胺、吉西他滨联合谷氨酰胺均能降低XIAP的表达，且联合用药组人肺腺癌A549细胞增殖抑制率及细胞凋亡率均高于吉西他滨组和谷氨酰胺组，表明谷氨酰胺能增强吉西他滨的抗肿瘤作用。

综上所述，谷氨酰胺能抑制人肺腺癌A549细胞增殖，促进凋亡，联用吉西他滨时能明显增强吉西他滨对

人肺腺癌细胞的抑制作用，可能与通过下调XIAP表达从而增强肺癌细胞对吉西他滨的敏感性有关，但其具体机制尚有待于进一步研究。

[1]赵建平，王媛媛，阎玉虎.吉西他滨对人非小细胞肺癌A549细胞增殖与凋亡的影响[J].肿瘤防治研究，2006，33（2）：100⁃102.

[2]赵钰玲，董娅，范亚莉，等.吉西他滨对人非小细胞肺癌A549、H1299细胞增殖及凋亡的影响[J].陕西医学杂志，2017，46（6）：683⁃685.

[3]THATCHER N，HIRSCH FR，LUFT AV，et al.Necitumumab plus gem⁃citabine and cisplatin versus gemcitabine and cisplatin alone as first⁃line therapy in patients with stageⅣsquamous non⁃small⁃cell lung cancer（SQUIRE）：an open⁃label，randomised，controlled phase 3 trial[J].Lancet Oncol，2015，16（7）：763⁃774.

[4]王立文，沈晓洁，彬彬.非小细胞肺癌中lncRNA MVIH与吉西他滨耐药的相关性研究[J].重庆医学，2017，46（7）：946⁃948.

[5]MARTINS HA，SEHABER CC，HERMES⁃ULIANA C，et al.Supplemen⁃tation with L⁃glutamine prevents tumor growth and cancer⁃induced cachexia as well as restores cell proliferation of intestinal mucosa of Walker⁃256tumor⁃bearingrats[J].AminoAcids，2016，48（12）：2773⁃2784.

[6]FRACAROL，FREZFC，SILVABC，etal.Walker 256tumor⁃bearingrats demonstrate altered interstitial cells of Cajal.Effects on ICC in the walker 256tumormodel[J].NeurogastroenterolMotil，2016，28（1）：101⁃115.

[7]JEONG SM，HWANG S，PARK K，et al.Enhanced mitochondrial gluta⁃mine anaplerosis suppresses pancreatic cancer growth through autophagy inhibition[J].Sci Rep，2016，6：30767.

[8]TODOROVA VK，HARMS SA，KAUFMANN Y，et al.Effect of dietary glutamine on tumor glutathione levels and apoptosis⁃related proteins in DMBA⁃induced breast cancer of rats[J].Breast Cancer Res Treat，2004，88（3）：247⁃256.

[9]BIANCHI A，UGAZZI M，FERRANTE L，et al.Rational design，synthesis and characterization of potent，drug⁃like monomeric Smac mimetics as pro⁃apoptotic anticancer agents[J].Bioorg Med Chem Lett，2012，22（6）：2204⁃2208.

[10]ECKELMAN BP，SALVESEN GS，SCOTT FL.Human inhibitor of apoptosis proteins：why XIAP is the black sheep of the family[J].EMBO Rep，2006，7（10）：988⁃994.

[11]QIN S，YANG C，ZHANG B，et al.XIAP inhibits mature Smac⁃induced apoptosis by degrading it through ubiquitination in NSCLC[J].Int J Oncol，2016，49（4）：1289⁃1296.

[12]GOLOVINE K，MAKHOV P，UZZO RG，et al.Cadmium down⁃regu⁃latesexpressionofXIAPatthepost⁃transcriptionallevelinprostatecancer cells through an NF⁃kappaB⁃independent，proteasome⁃mediated mecha⁃nism[J].Mol Cancer，2010，9：183.

[13]ZHOU S，YE W，SHAO Q，et al.Prognostic significance of XIAP and NF⁃κB expression in esophageal carcinoma with postoperative radiothera⁃py[J].World J Surg Oncol，2013，11：288.

[14]张潜，王洪林.吉西他滨诱导胰腺癌细胞BxPC⁃3中XIAP基因表达的研究[J].中国癌症杂志，2010，20（2）：105⁃109.

[15]王兆洪，徐锦波，陈敏远，等.大黄素通过下调XIAP的表达增强吉西他滨对胰腺癌的抑瘤作用[J].中国药学杂志，2014，49（23）：2083⁃2087.