槐猪FTO基因遗传多态性及其与肉质性状相关性研究

许卫华，赵殿强，黄 芬，李虹仪，张 茂，孙艳发

（1. 福建龙岩学院生命科学学院，福建 龙岩 364012；2. 福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室，福建 龙岩 364012）

随着生活水平的日益提高，以肉质鲜嫩、肌内脂肪含量高、风味浓厚为优势的地方品种及其杂交培育品种越来越受到消费者的青睐，也引起了国内外育种公司和投资机构的广泛关注。因此，对地方品种诸如脂肪沉积能力强、肌内脂肪含量高，甚至早熟等优秀性状形成的分子遗传基础研究，显得尤为迫切。此外，肥胖正成为一个日益严重的全球性问题，猪作为一个良好的动物模型，在研究人类肥胖候选基因的研究中发挥重要作用［1］。

FTO基因被发现与人类肥胖相关，因此也称为肥胖基因［2］。该基因与儿童肥胖、成年人过度肥胖以及体重质量指数相关［3-6］。FTO基因编码氧化戊二酸依赖型去甲基化核酸酶，主要在大脑中表达，参与调节饮食［7］，同时在脂肪组织中也有表达，参与脂肪分解反应，从而维持体内脂肪能量平衡［8］。在小鼠模型中，FTO基因的过度表达会提高其采食量并导致肥胖，而且饲喂高脂食物给小鼠会产生葡萄糖耐受不良反应［9］。猪FTO基因位于第六染色体上［10］，与背膘厚度、平均日增重等数量性状基因座（QTL）毗连。研究发现，猪FTO基因5′-UTR区域、内含子、外显子以及3′-UTR区域均存在大量的单核苷酸突变（SNP）［11-18］。其中，Fan等［11］发现巴克夏猪×大白猪资源群体中，该基因第一内含子c.46-139A＞T及第三外显子c.594C＞G位点各基因型与平均日增重及肌内脂肪总量存在极显著的相关性；Dvořáková等［12］在多个杂交商品猪中发现该基因g.400C＞G位点（本研究中等同于c.594C＞G位点）等位基因C与背膘厚度显著相关；Szydlowski等［13］在波兰大白猪、波兰长白猪及大白×长白杂交猪群中发现，FTO基因的5′-UTR区域g.167 T＞G位点与背膘厚度、腹脂重量显著相关；陶新等［17］发现金华猪中c.594 C＞G位点存在遗传多态性；杨攀等［18］发现国内两个地方品种（大围子猪和宁乡猪）与国外两个品种（杜洛克猪和大白猪）在FTO基因第四内含子g.276G＞T位点遗传多态性存在较为明显差异。

综上所述可知，国内外相关研究均发现FTO基因各遗传突变位点遗传多态性及其与肉质性状的相关性存在品种间差异，并且认为FTO基因是一种潜在的分子遗传标记。槐猪是福建省首批列入“国家级畜禽品种资源保护名录”的地方优良品种猪，广泛分布于福建省闽西南山区，主产地位于福建省上杭县、漳平市、新罗区等县市。槐猪具有早熟、耐粗饲、脂肪沉积能力强、肉质好等特性。截至目前还没有公开发表有关槐猪FTO基因遗传多态性的研究报道。为此，本研究选择3个遗传多态性丰富且与肉质性状存在一定相关性的突变位点g.167 T＞G、c.46-139A＞T和c.594C＞G，研究其在槐猪品种内的遗传多态性及其与肌内脂肪含量（Intramuscular Fat，IMF）、背膘厚度（Backfat Thickness，BFT）和眼肌面积（Loineye Area，LEA）等主要肉质性状的相关性，为上杭槐猪优质系培育过程中开展肉质性状的分子标记辅助育种提供基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

在相同季节分6批次收集50头体重为72.5～77.5 kg的槐猪（去势公猪和母猪各半）样本。槐猪育肥期饲喂条件相同，以采食煮熟地瓜皮并配饲槐猪专用颗粒精补饲料为主。采集倒数第3～4肋骨背最长肌肌肉样品，置于冰盒中带回实验室，用于提取DNA的肌肉样品保存于-80℃冰箱。

1.2 试剂

内切酶EcoRⅠ、XapⅠ和Bsh1236Ⅰ购自Fermentas公司；E.Z.N.A.® Tissue DNA Kit购自OMEGA公司；PCR 试剂盒购自Qiagen公司；DNA Marker购自大连宝生生物工程有限公司。

1.3 基因组DNA提取

参照E.Z.N.A.® Tissue DNA Kit操作说明书提取基因组DNA，用50～100 μL的洗脱缓冲液洗脱DNA，-20℃保存备用。

1.4 引物设计

参照文献［11，13］设计引物对，引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。详细的引物及PCR-RFLP信息见表1。

表1 FTO基因3个SNP的扩增引物及PCR-RFLP相关信息

1.5 PCR-RFLP

根据PCR试剂盒配制反应体系。扩增条件：95℃预变性 5 min；95℃ 20～30 s、50～58℃20～45 s、72℃ 1 min，30～35 循环；72℃延伸10 min；4℃结束反应。

PCR 扩增产物采用15μL酶切体系，包括：PCR产物10 μL，限制性内切酶1μL，10×buffer 2 μL，灭菌双蒸水2μL。根据3种限制性内切酶说明书确定酶切反应条件，酶切产物用2.0%～3%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.6 群体遗传分析

基因频率、基因型频率以及多态信息含量（PIC）计算参照文献［14］，其中，PIC值＞0.5为高度多态，0.25～0.5为中度多态，＜0.25为低度多态。通过卡方检验（χ2test）判定各位点基因型是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。

1.7 肉质性状测定与数据分析

参照《猪肌肉品质测定技术规范（NYT 821-2004）》测定肌内脂肪含量、背膘厚度和眼肌面积。背膘厚度、眼肌面积以及反正弦变换后肌内脂肪含量，用SPSS 20.0 One-Way ANOVA程序进行方差分析和Duncan多重比较，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 槐猪FTO 基因PCR-RFLP结果

利用PCR-RFLP技术对槐猪FTO基因g.-167 T＞G、c.46-139 A＞T和 c.594 C＞G 等 3个位点的PCR片段进行EcoRⅠ、XapⅠ和Bsh1236Ⅰ限制性酶切，按照表1的酶切结果进行相应的分型，酶切图谱见图1～图3。

2.2 槐猪FTO 基因各RFLP位点遗传多态性及其与肉质性状的相关性分析

图1 EcoRⅠ酶切848 bp PCR 产物电泳结果

图2 XapⅠ酶切197 bp PCR 产物电泳结果

本试验对供试的50头槐猪中43份（20公、23母）样本成功进行PCR-RFLP分型分析。对FTO基因3个SNP位点各等位基因型频率、基因频率、Hardy-Wenberg遗传平衡以及多态信息含量（PIC值）进行计算（表2），并与肌内脂肪含量、背膘厚度、眼肌面积等肉质性状进行相关性分析（表3）。

图3 Bsh1236Ⅰ酶切240 bp PCR 产物电泳结果

从表2可以看出，槐猪FTO基因在g.-167 T＞G、c.46-139 A＞T和 c.594 C＞G 等 3个位点均表现出一定的遗传多态性，PIC值分别为0.276、0.343和0.235；3个位点优势基因型分别为GG、TT和GG基因型，优势等位基因分别为G、T和G等位基因。从表3可以看出，在g.-167 T＞G位点，TT基因型个体肌内脂肪含量显著高于GG基因型；c.46-139 A＞T位点，AA基因型个体背膘厚度显著高于TT基因型；c.594 C＞G位点，各基因型个体在3个肉质性状上没有表现出显著相关性。

表2 FTO 基因3个SNP的遗传多态性

表3 FTO 基因遗传多态性及其与槐猪肉质性状的相关性

3 讨论

本研究中，槐猪FTO基因g.-167 T＞G位点，T等位基因有利于提高肌内脂肪含量，这与Szydlowski等［13］的报道相近，该研究在波兰大白猪（PLW）、波兰长白猪（PL）和一个合成品系（L990）猪群中发现T等位基因有降低肌内脂肪含量的趋势（P＞0.05），此外，T等位基因还显著降低了杂交小母猪的背膘厚度、腹部脂肪含量和提高了瘦肉含量。然而，本研究并没有发现槐猪各基因型个体间在背膘厚度以及眼肌面积两个性状上存在显著相关性。Chen等［20］发现肌间脂肪组织前脂肪细胞中FTO基因的过表达显著促进了细胞分化和脂肪沉积，提示FTO基因的选择有可能通过影响FTO基因的不同表达水平，进而影响肌内脂肪细胞的增生和脂肪的沉积。槐猪c.46-139A＞T位点T等位基因有利于降低背膘厚度，而Fan等［11］发现T等位基因在巴克夏猪×大约克猪资源群中有利于提高平均日增重，如果认为背膘厚度与平均日增重呈显著负相关，则本研究中T等位基因降低背膘厚度的发现与该文研究结果相一致。本研究中并未发现c.594 C＞G位点各基因型在背膘厚度、肌内脂肪含量和眼肌面积3个性状上表现出显著的相关性，而Fan等［11］在巴克夏猪×大约克猪资源群和Dvořáková等［12］在梅山猪×皮特兰F2资源群中均发现该位点和被研究的肉质性状间表现出一定的相关性，这可能是因品种间遗传差异所致。陶新等［17］发现金华猪的c.594C＞G位点基因型结构与3个外来猪种（杜洛克、大白猪和长白猪）存在差异，金华猪在该位点以GG型为优势基因型，这与本研究结果一致。此外，杨攀等［18］也发现国内两个地方品种（大围子猪和宁乡猪）与国外两个品种（杜洛克猪和大白猪）在FTO基因第四内含子g.276G＞T位点的遗传多态性存在较为明显的差异。

综上，槐猪在FTO基因g.-167 T＞G、c.46-139 A＞T和c.594 C＞G等3个位点的遗传多态性与分子遗传标记功能具有独特性，其中，g.-167 T＞G和c.46-139A＞T两个SNP可作为槐猪肉质性状选育的潜在分子遗传标记，然而本研究虽然保证了被测槐猪相同的饲喂条件，由于部分基因型个体在各自性别中数量太少，无法从统计学水平剔除性别对基因型与肉质性状相关性的影响，因此，本研究结果仍应在更大的群体中作进一步验证。

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