不同品种鸡蛋花叶片和花瓣中抗坏血酸含量及其抗氧化生理指标差异性研究

周丽萍，俞 乐，高 彬，吴宇东，董晓静，朱慧敏，刘拥海

（1.肇庆学院生命科学学院，广东 肇庆 526061；2.肇庆学院植物逆境生物学研究中心，广东 肇庆 526061）

鸡蛋花（Plumeria rubra L. cv. Acutifolia）又名缅栀子、鹿角树、蛋黄花、擂捶花和大季花灯，属夹竹桃科植物，原产于墨西哥、委内瑞拉及西印度群岛等美洲热带地区，是热带、南亚热带地区常见的园林花卉植物［1-3］。其花极芳香，干花可食，树皮及白色胶乳可入药［4-5］；树形美观，具有很高的观赏价值，鸡蛋花属植物在园林上的应用多见于公共绿地、庭园和庙宇等场所［6］。但我国种类普遍单一，多为原种红鸡蛋花（Plumeria rubra L.）和鸡蛋花（Plumeria rubra‘Acutifolia’）。近年来，世界热带、亚热带各地区广泛引种栽培鸡蛋花，并不断有杂交新品种出现。目前，越来越多的鸡蛋花新品种引进我国，且正逐步应用于园林造景［1-2］。

目前对鸡蛋花的抗逆性及生长适应性的研究并不多见［6-9］。本研究以从国外引进的5个鸡蛋花品种为试材，对其叶片和花瓣的抗坏血酸（AsA）、叶绿素（Chl）、类胡萝卜素（Car）、丙二醛（MDA）、类黄酮含量，过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，以及花瓣的原花青素（OPC）含量进行分析，为选育适合本土生长且观赏价值高的优良品种，并将其应用到园林绿化创造丰富的植物景观奠定基础。引种植物在当地的生长状况与其生长适应性息息相关，引种植物的抗性越强，其适应能力也越强。因此，通过分析植物的抗性生理指标并结合植物的观赏特性，从中筛选出适应性强、观赏价值高的新品种是目前观赏园林植物引种的有效可取途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究选取广东肇庆市白土镇刘村试验基地5个从国外引入的鸡蛋花品种为试材，包括琴叶鸡蛋花（Plumeria pudica ‘Jacq’，简称Ja）、橙桃子（Plumeria rubra ‘Orange Peach’，简称Op）、粉蝴蝶（Plumeria rubra ‘Butterfly Pink’，简称Bp）、丽雅 （Plumeria rubra‘Catthaleeya’，简称Ca）和谢尔曼（Plumeria rubra ‘Sherman’，简称Sh）。2016年8月27日上午，室温26～34℃，于田间随机选取生长一致的植株，采集同一部位的叶片和花瓣，样品保存在–80℃冰箱备用。

1.2 试验方法

1.2.1 叶形、花冠形态颜色及株形观测 于田间随机选取生长一致的鸡蛋花植株，观测植株的叶形、花冠形态颜色及株形。每个品种鸡蛋花选取同部位的叶片8～10片，花朵8～10个，用钢卷尺测量其叶长、叶宽以及花冠直径，拍照，记录数据。

1.2.2 AsA和脱氢抗坏血酸（DHA）含量测定 AsA和DHA含量的测定参考Kampfenkel等［10］方法，稍作改进。称取叶片和花瓣各0.1 g，分别加入1 mL预冷的6%（W/V）三氯乙酸（TCA）在冰浴中研磨成匀浆，立即在12 000 r/min、4℃下离心15 min，收集上清液。AsA含量测定：0.5 mL反应体系中含25 μL上清液、75 μL 0.2 mol/L 磷酸缓冲液（PBS，pH7.8）、25 μL H2O、125 μL 10%（W/V）TCA、100 μL 42%（W/V）H3PO4、100μL 4%（W/V）联吡啶、50 μL 3%（W/V）FeCl3，混匀后放入42℃恒温金属浴中保温40 min，于波长525 nm处测定OD值。总抗坏血酸含量测定：0.5 mL反应体系中含25μL上清液、25μL 10 mmol/L二硫苏糖醇（DDT）、50μL 0.2 mol/L磷酸缓冲液（PBS，pH7.4），混匀后42℃水浴中保温15 min，再加入25 mL 0.5%（W/V）N-乙基顺丁烯二酰亚胺（N-ethylmaleimide，NEM）终止反应，其余步骤与测定AsA含量的反应体系相同。空白参照均用相同体积的6% TCA替代上清液。同样方法制作标准曲线后，计算AsA和总抗坏血酸含量，DHA含量为二者之差。

1.2.3 Chl、Car含量测定 Chl含量测定参考舒展等［11］方法。称取叶片0.1 g，剪去主脉后将其剪碎，分别置于含有10 mL丙酮∶乙醇（1∶1）混合溶液中暗处浸提72 h，提取液摇匀后分别在663、645、470 nm波长下测定OD值。根据以下公式计算Chl a、Chl b和Car含量：Chl a （mg/L）= 12.21×OD663nm-2.81×OD645nm，Chl b （mg/L）= 20.13×OD645nm-5.03×OD663nm，Car （mg/L） =（1000×OD470nm-3.27×Chl a - 104×Chl b） /229。

1.2.4 MDA含量测定 参照赵世杰等［12］方法，称取叶片和花瓣各0.1 g，分别加入0.5 mL 10% TCA研磨成匀浆，再加入0.8 mL 10% TCA进行洗涤，合并匀浆液后10 000 r/min离心10 min，上清液即为MDA待测液。用硫代巴比妥酸比色法用分光光度计于波长532、450 nm处测定OD值。根据公式C （μmol/L） =6.45×OD532nm- 0.56×OD450nm计算MDA浓度。

1.2.5 POD活性测定 POD活性测定参考Amako等［13］采用的愈创木酚比色法，分别称取0.1 g叶片和花瓣，加入1 mL预冷的0.05 mol/L磷酸缓冲液（pH7.8），在冰浴中研磨成匀浆，10 000 r/min、4℃离心10 min，取上清液测定2 min内470 nm处的OD值变化，定义光吸收值每分钟变化1.0为1个酶活性单位（U）。

1.2.6 SOD活性测定 SOD活性测定参照Prochazkova［14］方法，称取0.1g叶片和花瓣，分别加入1 mL预冷的0.05 mg/L磷酸缓冲液（pH7.8），冰浴匀浆后，在10 000 r/min、4℃离心15 min，取上清液于波长560 nm处测定OD值。定义吸收值每分钟变化1.0为1个酶活性单位（U）。

1.2.7 类黄酮含量测定 类黄酮含量的测定使用类黄酮测定试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）。

1.2.8 原花青素（OPC）含量测定 OPC含量测定使用OPC测定试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）。

采用Excel和SPSS 20.0统计软件进行数据处理和统计分析。数据比较采用单因素方差分析法。

2 结果与分析

2.1 不同品种鸡蛋花的叶形、花冠形态颜色及株形差异

由图1A（彩插一）、图1B（彩插一）可见，Ja叶型奇特，呈匙形；Op叶为长椭圆形，叶基楔形；Bp叶呈卵状倒披针形至长椭圆形；而Ca叶为长圆形，Sh叶为长椭圆形。此外，5个鸡蛋花品种的花冠颜色和形态也有较大区别，Ja花色雪白，花心鲜黄色，花瓣呈椭圆形，中度重叠；Op花为紫红色，花心橙黄色，花瓣呈阔卵形，较宽，花瓣边缘上卷明显，高度重叠；Bp花为粉红色略带淡紫色，花瓣边缘颜色较深，花心橘黄色，花瓣较窄且呈长椭圆形，轻度重叠；Ca花主体为奶白色，花瓣边缘淡紫红色，花心深黄色，花瓣宽阔，近圆形，中度重叠；Sh花色雪白，花心鲜黄色，花瓣呈较窄长的椭圆形，轻度重叠（图1C，彩插一）。另外，从株形来看，Ja株形较为矮小，叶浓密，郁郁葱葱；Op株形较为紧凑、饱满，叶姿上扬；而Bp、Ca和Sh均呈开张株型，Bp叶姿稍紧凑、浓密，Ca和Sh则叶姿舒展、疏密适中（图1D，彩插一）。

2.2 不同品种鸡蛋花的叶长、叶宽及花冠直径差异

由表1可知，5个品种鸡蛋花中Ja叶长最短，与其他4个品种差异显著。叶宽较宽的为Op、Bp和Ca，分别为11.83、12.20、11.13 cm，Sh叶宽居中，而Ja叶宽最窄，仅为6.44 cm。另外，5个品种鸡蛋花的花冠直径均存在显著差异，其中Sh花冠直径最大，之后依次为Bp、Ca、Ja和 Op。

表1 不同品种鸡蛋花的叶长、叶宽及花冠直径差异

2.3 不同品种鸡蛋花叶片和花瓣AsA含量和AsA/DHA差异

图2显示，5个品种鸡蛋花叶片的AsA含量存在差异，其中Op叶片AsA含量最高、约2.38 μmol/g（FW），分别为 Ja、Bp、Ca和 Sh的1.59、1.15、1.28和1.34倍，差异显著。而Op和Sh花瓣的AsA含量较高，分别为3.54、3.55 μmol/g（FW），与其他3个品种差异显著，Ja、Bp和Ca花瓣的AsA含量分别为Sh的47.83%、76.33%和71.44%。5个鸡蛋花品种中叶片AsA/DHA为Op最高、达0.33，Bp最低、为0.19，两者差异显著。此外，Ja花瓣的AsA/DHA为0.38，显著高于Bp、Ca和Sh。

2.4 不同品种鸡蛋花叶片Chl和Car含量差异

由表2可知，不同品种鸡蛋花叶片的Chl a含量之间存在差异，Ca的Chl a含量最高，Sh最低。此外，Chl b含量也存在差异，同样是Ca最高，Sh最低。Car含量最高的为Ca和Op。

图2 不同品种鸡蛋花叶片和花瓣的AsA含量和AsA/DHA差异

表2 不同品种鸡蛋花叶片叶绿素和类胡萝卜素含量差异

2.5 不同品种鸡蛋花叶片和花瓣MDA含量差异

图3结果显示，5个品种鸡蛋花叶片MDA含量较低的是Op和Sh，分别为0.009、0.010 μmol/g（FW），Ja、Bp和Ca的叶片MDA含量均显著高于Op、Sh，其中Bp、Ca分别高达0.022、0.021μmol/g（FW）。另外，花瓣MDA含量最低的是Ja，约为0.008μmol/g，FW，Sh次之，约为0.020μmol/g（FW），而Op、Bp和Ca显著高于Ja，分别是Ja的7.34、6.92和7.54倍。

图3 不同品种鸡蛋花叶片和花瓣的MDA含量差异

2.6 不同品种鸡蛋花叶片和花瓣POD活性差异

从图4可以看出，5个不同鸡蛋花品种叶片的POD活性存在差异。Bp活性最高，而Ja活性最低，仅为Bp的18.99%。另外，与叶片相似，花瓣的POD活性也是Bp最高，分别为Ja、Op、Ca和Sh的2.99、5.31、3.17和2.24倍，差异显著。

图4 不同品种鸡蛋花叶片和花瓣的POD活性差异

2.7 不同品种鸡蛋花叶片和花瓣SOD活性差异

研究结果显示，5个不同品种鸡蛋花叶片的SOD活性存在差异（图5），Ca的SOD活性最高，约为17.71 U/min·g（FW），Op和Bp的SOD活性分别是Ca的86.33%和92.63%，差异显著（图5）。花瓣SOD活性最高的为Op，约为15.41 U/min·g（FW），Ja最低，仅为Op的53.51%。

图5 不同品种鸡蛋花叶片和花瓣的SOD活性差异

2.8 不同品种鸡蛋花叶片和花瓣类黄酮含量差异

从图6可以看出，Ca叶片的类黄酮含量显著高于其他4个品种，含量约为5.70 mg/g（FW），Ja、Op、Bp和Sh叶片的类黄酮含量分别为Ca的67.02%、56.07%、60.69%和76.83%（图6）。5个鸡蛋花品种花瓣的类黄酮含量差异显著，Bp的类黄酮含量含量最高，约为42.16 mg/g（FW），含量最低的为Ja，约6.65 mg/g（FW），而Op、Ca和Sh分别是Ja的4.47、2.98和1.35倍。

2.9 不同品种鸡蛋花花瓣OPC含量差异

图7显示，Ca花瓣的OPC含量最高，与Ja相近，二者无显著差异，而Op和bp花瓣的OPC含量显著低于Ja和Ca。Sh花瓣的OPC含量最低，含量约0.64 mg/g（FW），与其他4个品种的差异显著，Ja、Op、Bp和Ca分别是Sh的1.95、1.60、1.67和2.01倍。

3 结论与讨论

近年来，越来越多的新品种鸡蛋花引进我国并逐步应用于园林造景［1-3］。新品种鸡蛋花花色多样，形态优美，本研究中的鸡蛋花白色系有Ja、Ca和Sh 3个品种，红色系有Op和Bp两个品种，其中Ca的花瓣边缘呈淡紫红色，较为少见。5个品种鸡蛋花的叶形分别呈钥形、长椭圆形，卵状倒披针形和长圆形。另外，Ja的花形和株形均较为独特，其花颜色雪白、花心鲜黄色，花形紧凑，花期长，株形小巧，树姿屹立傲然，叶深绿色，郁郁葱葱，气味清香，高贵典雅，珍奇独特，特别适合庭院载种，具有较高的观赏价值。

图6 不同品种鸡蛋花叶片和花瓣的类黄酮含量差异

图7 不同品种鸡蛋花花瓣的OPC含量差异

分析植物的抗氧化生理指标并结合植物的观赏特性，筛选适应性强、观赏价值高的新品种是目前观赏园林植物引种的有效可取途径。活性氧清除系统是植物抗氧化的重要组成部分，植物能形成酶促系统和非酶促系统来清除氧自由基，确保体内活性氧的产生和清除处于动态平衡状态，确保植物细胞免受活性氧的伤害［16］。植物酶促系统主要包括POD、SOD和CAT等，非酶促系统则包括AsA、GSH、维生素E和类胡萝卜素等，其中AsA作为重要的抗氧化剂参与植物的衰老调控。前人研究结果表明，植物中的AsA含量与抗逆性呈正相关，提高AsA含量或促进氧化态AsA的还原都能提高植物的生长适应性［17-19］。俞乐等［20］以日本结缕草和细叶结缕草为材料，发现在干旱胁迫2种结缕草的AsA含量和AsA/DHA均呈现先上升后下降的变化趋势。金基石等［21］研究表明，AsA对‘Samantha’月季切花失水胁迫耐性的改善与花瓣中APX活性的提高相关。本研究结果显示，Op叶片的AsA含量均显著高于其他4个品种，其花瓣的AsA含量也显著高于Ja、Bp和Ca，说明Op的抗氧化能力和抗逆性可能优于其他品种。

前人研究结果显示，不同品种鸡蛋花的天然抗氧化活性成分含量有所不同［8-9］。刘晓辉等［8］以常见的黄白和粉红2种花色鸡蛋花为材料，测定其叶片、花萼和花瓣的黄酮、SOD、维生素C、叶绿素、蛋白质以及糖类等含量，结果表明不同品种或同一品种鸡蛋花不同器官的各物质含量均有所不同。薛玉花等［9］对两个不同品种鸡蛋花的适应性研究表明，红花品种的抗寒性优于白花品种，且红花品种比白花品种对温室环境的适应性强。本研究结果表明，Bp和Ca叶片的Chl a和Chl b含量较高，Op和Ca的Car含量较高，而Sh叶片的Chl a、Chl b和Car含量均较低，可见Op、Bp和Ca的光合作用能力要优于Sh。研究表明，Chl含量下降不仅影响草坪草的色泽，且影响光合作用，进而影响生长［20］。宋莎等［22］测定不同苹果砧木 Chl含量与光合速率关系，得出苹果砧木Chl含量与净光合速率呈显著正相关。

令凡等［23］对6个油橄榄品种进行低温胁迫（5、0、-5、-10℃）处理，结果显示皮削利的SOD、POD等抗氧化酶活性均显著高于其他品种，表明SOD、POD活性与抗寒性呈正相关。刘筱等［24］研究铅胁迫对紫萼玉簪幼苗SOD，POD和CAT活性的影响，表明紫萼玉簪幼苗叶片SOD、CAT活性随铅胁迫浓度升高呈现先升后降的趋势，POD活性则始终保持较高，三者对铅胁迫的敏感性有所区别。本研究中，Bp叶片和花瓣的POD活性均显著高于其他4个品种，而Ca叶片和花瓣则表现出较高的SOD活性，表明不同品种鸡蛋花的植物细胞有可能选择不同酶作为主要的抗氧化保护酶，在清除活性氧中起主要作用。MDA是植物细胞膜膜脂过氧化的产物，其含量高低常被作为判断膜脂过氧化伤害的重要指标，MDA含量与植物遭受逆境伤害时抵御能力成反比［25-26］，其变化往往可以反映植物对逆境条件抗性的强弱［27］。本研究结果表明，Op和Sh叶片的MDA含量较低，明显低于其他3个品种，而花瓣的MDA含量则为Ja最低，可见在正常种植条件下，鸡蛋花叶片和花瓣的MDA含量水平并未呈现出一致的变化趋势，这可能与叶片和花瓣作为不同器官在植物生长过程所起的作用不同有关。

黄酮类物质具有较强的清除超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧化氢等能力［28］。宋晓敏等［29］研究结果表明，随着NaCl浓度升高，秋茄叶片类黄酮含量显著增加，MDA含量显著降低，活性氧自由基清除率显著增加。彭祺等［30］以大豆幼苗为材料，研究了镧对UV-B辐射胁迫下大豆幼苗类黄酮抗氧化能力的动态影响，表明UV-B辐射胁迫下，大豆幼苗类黄酮含量在胁迫期和恢复期均先升后降，对自由基清除率与其含量变化趋势近同。本研究中，不同品种鸡蛋花叶片的类黄酮含量由高至低依次为Ca＞Sh＞Ja＞Bp＞Op，花瓣中依次为 Bp＞ Op＞Ca＞Sh＞ Ja，花瓣的类黄酮含量高于叶片，如Bp花瓣类黄酮含量是叶片的10倍以上。可见，类黄酮有可能作为鸡蛋花花瓣的主要抗氧化剂，在花器官的抗氧化中起重要作用。而OPC是自然界广泛存在的聚多酚类混合物，具有抗氧化、清除自由基、抗诱变的能力［31］。周玮婧等［32］探讨了荔枝皮原花青素、AsA以及维生素E的协同抗氧化作用，结果表明荔枝皮OPC对DPPH自由基有明显的清除作用。羊芹等［33］对柳树叶的OPC抗氧化性的研究表明，OPC的抗氧化性较AsA强，总抗氧化力和还原力及对亚硝酸根离子NO2-清除作用约为AsA的2倍。本研究中，Sh花瓣的OPC远低于其他4个品种，说明不同品种鸡蛋花花瓣的OPC含量存在差异。

在正常种植条件下，本研究选用的5个品种鸡蛋花叶片和花瓣的AsA、Chl、Car和MDA含量、POD和SOD活性、类黄酮含量以及花瓣的OPC含量存在不同程度差异，表明不同鸡蛋花品种在清除活性氧中有可能选择不同的抗氧化剂起主要作用，其中Op叶片的AsA和Chl含量较高，而MDA含量较低，说明Op植株的抗氧化能力、光合能力和抗逆性可能优于其他品种。另外，Bp叶片和花瓣的POD活性均较高，说明Bp植株可能选择POD和SOD作为主要的抗氧化保护酶，在清除活性氧中起主要作用。值得注意的是，本研究发现鸡蛋花花瓣的类黄酮含量远高于叶片，说明类黄酮有可能作为花瓣的主要抗氧化剂，在花器官抗氧化中起重要作用。通过对植物的抗性生理指标并结合植物的观赏特性分析可知，筛选出适应性强、观赏价值高的新品种是观赏园林植物引种的有效可取途径。

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