针刺对脑缺血再灌注大鼠梗死灶边缘区顶叶皮质 TLR9、TNF-α、IRF7和 IFN-β 的mRNA表达的影响*

许军峰 ，张 浪 ，田 骞 ，郭士明 ，李文博

（1.天津中医药大学第一附属医院针灸特需科，天津 300193；2.中国中医科学院博士后科研流动站，北京 100700；3.陕西省子长县人民医院，子长 717300；4.天津市东丽区中医院，天津 300399；5.天津中医药大学，天津 300193）

脑梗死是临床上的一种常见病、多发病，其发病率占脑卒中60%～80%[1]，脑缺血损伤导致中枢神经系统神经细胞缺失和神经网络损伤，患者神经功能损伤引起运动功能不同程度受限[2]。目前临床上治疗脑卒中后并发症的方法很多，其中针刺法在治疗缺血性脑卒中康复期不存在血脑屏障[3-6]。本研究将从Toll样受体9（TLR9）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素调节因子 7（IRF7）、干扰素-β（IFN-β）因子的mRNA表达方面阐释针刺治疗中风病的机制，研究针刺的抗损伤修复及脑保护机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组与取材 选择健康成年雄性SD大鼠36只，体质量280～300 g，SPF由中国医学科学院实验动物中心配送。按随机数字表分为模型组（即手术组）、假手术组和针刺组，每组12只大鼠。3组按再灌注时间点和脑组织取材来源分为：6 h缺血侧（I1）、5 d缺血侧（I2）两个亚组，每个时间段各6只。I1和I2在梗死灶边缘区顶叶皮质取材。

1.2 大鼠脑缺血再灌注模型的建立 大脑中动脉闭塞模型参照改良Zea Longa氏线栓法[7]制备右侧脑缺血，在大脑中动脉阻塞90 min时，将线栓拔出至颈外动脉内达到再灌注。假手术组除不插入鱼线外，其他操作与手术组相同。神经病学评分参考Zealonga的5级4分法标准[8]。有效模型在1～4分。造模后的动物会有神经功能缺损症状，如偏瘫等。如有脑出血死亡者剔除。

1.3 针刺取穴及针刺方法 根据中国针灸学会实验针灸研究会制定的“动物针灸穴位图谱”，选用内关、水沟、三阴交3个穴位，取相应胁下固定点作为非穴点，使用苏州医疗用品厂生产的“华佗牌”毫针，40 mm×0.32 mm。先刺双侧内关：直刺0.3～0.5寸（同身寸，下同），施捻转提插泻法1 min；再刺水沟：斜刺0.3～0.5寸，用重雀啄法施手法4～6次；然后刺患侧三阴交，施提插补法，使患侧下肢抽动3次。非穴点针刺，施平补平泻手法1 min。6 h组仅针刺1次，5 d组针刺隔天1次，共3次。

1.4 荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）法检测 对大鼠予以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，开颅取脑，放于-20℃速冻30 min，组织切片自端脑前端开始，从前往后，每片厚1.5 mm。取大鼠前囟冠状面双侧额顶叶皮质，将其分别分装于清洁标本管中；液氮速冻后置-80℃保存备用。用超纯RNA试剂盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581）提取样本组织中的总RNA。实验操步骤参考说明书操作；取5 μL RNA，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳。用HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0744）进行反转录。实验操作步骤参考说明书操作。用ABI7500fast型荧光定量PCR仪，数据的相对定量分析采用2-△△CT法。根据Real Time PCR原始检测结果，按照2-△△CT相对定量计算公式，即

F=2-(对照组目的基因平均Ct值-对照组看家基因平均Ct值)-（待检样品月的基因平均Ct-待检样品看家基因平均Ct值）

计算出各样品目的基因相对定量的结果，即其他各个样品相对于对照样品（M51R），目的基因mRNA转录水平的差异。

1.5 统计学分析 采用SPSS for WindowsVer.18.0统计软件对所得数据进行统计学处理。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组内前后比较若满足正态分布用配对t检验，若呈偏态分布用配对秩和检验。多组间比较若满足正态分布采用单因素方差分析，若呈偏态分布采用秩和检验，p＜0.05为有统计学差异。

2 结果

针刺对脑缺血再灌注大鼠梗死灶边缘区顶叶皮质 TLR9、TNF-α、IRF7、IFN-β mRNA 表达的影响统计如下。

2.1 针刺对TLR9 mRNA表达的影响 不同分组、不同时间段、不同侧TLR9信号通路mRNA的表达对比均无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

表1 针刺对TLR9 mRNA表达的影响Tab.1 Effect of acupuncture on the expression of TLR9 mRNA

表1 针刺对TLR9 mRNA表达的影响Tab.1 Effect of acupuncture on the expression of TLR9 mRNA

组别 动物数 6 h 5 d模型组 6 0.724 0±0.3245 5 0.372 5±0.4207 4针刺组 6 0.608 0±0.1285 3 0.890 0±0.7658 0假手术组 6 0.364 0±0.1902 1 0.708 0±0.1355 4

2.2 针刺对TNF-α mRNA表达影响 模型组6 h、假手术组6 h、针刺组6 h、模型组5 d与针刺组5 d对比（p＜0.05），均存在统计学差异，针刺组5 d TNF-α mRNA表达明显升高。见表2。

2.3 针刺对IRF7 mRNA表达的影响 模型组5 d、假手术组5d与模型组6h比有统计学差异（p＜0.05），两者较模型组6 h明显降低。见表3。

表2 针刺对TNF-α mRNA表达的影响Tab.2 Effect of acupuncture on the expression of TNF-α mRNA

表2 针刺对TNF-α mRNA表达的影响Tab.2 Effect of acupuncture on the expression of TNF-α mRNA

注：与针刺组 5 d 比较，*p＜0.05。

组别 动物数 6 h 5 d模型组 6 0.090 0±0.021 21* 0.337 5±0.443 20*针刺组 6 0.178 0±0.048 68* 1.348 0±0.992 20假手术组 6 0.296 0±0.187 43* 0.464 0±1.176 00*

表3 针刺对IRF7的mRNA表达的影响Tab.3 Effect of acupuncture on the expression of IRF7 mRNA

表3 针刺对IRF7的mRNA表达的影响Tab.3 Effect of acupuncture on the expression of IRF7 mRNA

注：与模型组 6 h 比较，*p＜0.05。

组别 动物数 6 h 5 d模型组 6 2.368 0±0.986 39 0.272 5±0.485 07*针刺组 6 1.648 0±0.513 59 1.206 0±1.405 68假手术组 6 0.890 0±0.326 50 0.562 0±0.467 25*

2.4 针刺对IFN-βmRNA表达的影响 模型组6h、针刺组6 h、假手术组6 h组和针刺组5 d对比，存在统计学差异（p＜0.05），针刺组 5 d IFN-β mRNA表达明显增加。见表4。

表4 针刺对IFN-β mRNA表达的影响（Tab.4 Effect of acupuncture on the expression of IFN-β mRNA

表4 针刺对IFN-β mRNA表达的影响（Tab.4 Effect of acupuncture on the expression of IFN-β mRNA

注：与针刺组 5 d 比较，*p＜0.05。

组别 动物数 6 h 5 d模型组 6 0.984 0±0.727 14* 0.692 5±0.383 26针刺组 6 0.946 0±0.310 29* 2.508 0±1.355 31假手术组 6 0.220 0±0.111 36* 0.656 0±0.140 29

3 讨论

脑卒中目前临床上作为一种常见病，针刺治疗缺血性脑神经损伤元具有保护作用已被大量临床与实验所验证，在临床上取得显著疗效[9-11]。本实验以脑缺血后再灌注大鼠的TLR9 mRNA信号通路作为研究目标，研究针刺对脑缺血再灌注大鼠梗死灶边缘区顶叶皮质在不同时间点 TLR9、TNF-α、IRF7、IFN-β mRNA 表达的影响[12]，阐述针刺治疗中风病机制所在，结果显示针刺法增强神经保护因子IFN-β mRNA的表达。

脑缺血再灌注后6 h炎症因子IRF7、IFN-β mRNA明显增高，而因子TLR9和TNF-α增高不明显，可能与其启动时间不同有关。本研究尚不能表明该针刺能抑制TLR9 mRNA的表达，究其原因，脑缺血再灌注后TLR9信号通路被激活，随着机体自身的愈合，或者有效药物与有效方法的治疗，TLR9 mRNA的表达会降低，或许5 d尚在脑缺血再灌注后TLR9 mRNA表达的峰值之前。本针刺法5 d TNF-α mRNA表达对比明显增加，不能证明本针刺法能抑制TNF-α mRNA表达，甚至会诱发脑水肿、损害脑神经，故脑缺血再灌注损伤后至少5 d内不宜针刺。本研究表明该针刺法不能使IRF-7因子的mRNA表达下降，说明脑梗死有一定的自限性。IFN-β是一种神经保护因子，脑缺血再灌注后IFN-β mRNA表达增加，表明本针刺法能明显增强神经保护因子IFN-β mRNA的表达。

本实验从TLR9 mRNA信号通路的角度阐述针刺治疗中风的机制。脑缺血再灌注损伤大鼠经过针刺干预后，神经保护因子IFN-β信号mRNA的表达增强，神经功能活动障碍改善，能够减少脑缺血再灌注损伤影响的程度[13]。提示针刺对脑缺血大鼠的神经细胞保护机制之一，可能是通过增强神经保护因子IFN-β mRNA的表达而实现的。研究结果显示，每组6个样本，且标准差较高，实验过程中的质控有待提高，所得到的结论需要进一步探讨和验证。

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