HPLC法测定冻干粉针中AOH的含量

刘婷 杨建云 肖炳坤 杨怀霞 黄荣清

1.河南中医药大学药学院，郑州 450046；2.军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所，北京 100850

AOH是一种雄甾酮衍生物，具有抗糖皮质激素活性的作用[1]。AOH能够刺激机体细胞因子的分泌，促进辐射诱导造血损伤恢复，可以明显提高全身辐射小鼠和猕猴的存活率，增强机体辐射后抗感染能力，有很好的抗辐射效果[2-7]。此外，组织病理学检查和临床试验结果表明AOH的毒性较低[8]。AOH具有较强的抗辐射作用和较低的毒性，使其成为一个引人关注的候选抗辐射药物，对其进行含量测定可以为药物的有效性提供质量控制办法。AOH不溶于水而溶于有机溶剂，将AOH做成冻干粉针注射剂，可降低给药剂量，提高生物利用度[9]。AOH冻干粉针剂是一种注射给药新剂型，本文建立了一种简便、准确、可行、高效 的HPLC 分析方法，用于测定冻干粉针中AOH含量，为其质量控制奠定基础。

1 仪器与试药

仪器 ：Waters 2795 高效液相色谱仪（美国Waters 公司） ；2996 二极管阵列检测器 ；Empower 数据处理系统 ；BP211D型十万分之一天平（德国塞多利斯集团） ；KQ3200 型超声仪（宁波新芝生物科技股份有限公司），UV-2501PC 紫外分光光度仪（日本岛津公司）。色谱柱 Dikma, Diamonsil C18柱 (250mm×4.6 mm，5 μm)，甲醇和乙腈均为色谱纯，甘露醇、吐温80、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠均为分析纯（AR），PH6.0 PBS缓冲液为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的混合液，氢氧化钠（纯度≥96%)，盐酸（纯度为36%～38%），30%过氧化氢。AOH 对照品（含量：100.02%，军事医学科学院放射与辐射医学研究所自制）；AOH冻干粉针（含主药100 mg/瓶）及空白辅料（军事医学科学院放射与辐射医学研究所自制 )。

2 冻干粉针制备

称取AOH对照品13.0g，1.5g吐温80，3.0g甘露醇。将吐温80加入研钵，倒入甘露醇，研匀后采用少量递加法加入已研细 AOH 粉末，研磨均匀，加入 PBS 缓冲液，少量多次将上述药物辅料混合物从研钵转移至烧杯中，加入剩余PBS溶液，简单搅拌后，水浴超声处理15min，转入胶体磨研磨40min，中间停机10min散热，之后由胶体磨倒出，超声处理15 min后，用注射器吸取1.8mL混悬液置安瓿管内，冻干得疏松状固体后，封口即可。

3 溶液的制备

3.1 对照品溶液制备

取 AOH对照品约 25 mg，精密称定，置 50 mL量瓶中，加适量甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

3.2 供试品溶液制备

称取供试品约 25mg，精密称定，置 50 mL 量瓶中，加适量甲醇超声 15 min，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

3.3 空白溶液制备

称取处方量的空白辅料适量，置100mL量瓶中，用甲醇适量，超声处理15min，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液。

4 色谱条件与系统适用性试验

采用 Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱 ；流动相 ： 乙腈 - 水（45：55）；检测波长 206nm ；流速 1.0 mL·min-1；进样量20 μL ；柱温：室温。理论塔板数以 AOH计算不低于 5000。

按上述色谱条件，将对照品溶液、供试品溶液及空白辅料溶液分别进样，AOH 冻干粉针保留时间为 13.389 min，空白辅料在此处无色谱峰出现，说明辅料对 AOH检测无影响。色谱图见图 1。

图1 空白辅料

5 方法学验证[10]

5.1 检测限、定量限

取AOH约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，加乙腈超声溶解并稀释至刻度，摇匀，再用乙腈逐级稀释成一系列浓度，精密量取20μL，10μL，5μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。在信噪比（S/N）为3：1时测得的检测限为50ng，在信噪比（S/N）为10：1时测得的定量限为200ng。

5.2 线性关系考察

取对照品约50mg，精密称定，置50mL量瓶中，加乙腈超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别量取2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL溶液于10mL量瓶中，加乙腈超声溶解并稀释至刻度，摇匀，取20ul进样测定，记录色谱图。以峰面积 A 对浓度 C(mg·mL-1)进行线性回归，得回归方程是A=1E+07C-60480(n=7)（r=0.9994）。结果表明,AOH冻干粉针在0.2～0.8mg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。

5.3 仪器精密度试验

取浓度约为0.5mg/mL的标准品溶液，连续进样6次，每次20μL，以峰面积计算所得RSD为0.93%，表明仪器有良好的精密度。

5.4 稳定性试验

取一系列浓度为0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL的供试品溶液，分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、24h、48h、72h各取20μL进样，照“4”项下色谱条件测定峰面积。结果 24h 内 3 种浓度峰面积 RSD 分别为 0.63%、0.38%、0.68%，72h 内3 种浓度峰面积 RSD 分别为 1.47%、0.95%、1.47%，表明样品溶液在3天内比较稳定。

5.5 重复性试验

分别精密称取样品9份，配制成浓度为0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL的供试品溶液，每个浓度制备3份，照“4”项下色谱条件测定峰面积，按外标法以峰面积计算得平均标示量为0.67mg/mg。RSD为1.57%，表明方法有良好的重复性。

5.6 加样回收测定

取AOH冻干粉5瓶，将倾出内容物混匀后，精密称取供试品适量，9 份分别精密加入对照品适量，配制成低、中、高3种浓度，摇匀，过滤后进样 20 μL，测定回收率，结果（见表 1）AOH 冻干粉针平均回收率为 101.72%，RSD=1.21%。说明用本法测定 AOH 冻干粉针含量准确度良好。

表 1 AOH冻干粉针加样回收（n=9) 测定结果

5.7 专属性考察

为进一步考察色谱系统的分离效果，对样品分别进行了过氧化氢氧化破坏、碱破坏、酸破坏与加热破坏试验。

取AOH冻干粉适量，精密称定，置25mL量瓶中，照下述方法进行操作：酸破坏：用5mol·L-1的氢氧化钠10mL，90℃水浴中加热8h，再加5mol·L-1的盐酸，调节pH至中性，过滤，滤渣晾干；②碱破坏：用5mol·L-1的氢氧化钠10mL，90℃水浴中加热8h，再加5mol·L-1的盐酸，调节pH至中性，过滤，滤渣晾干；③氧化破坏：加30%过氧化氢10mL，放置3天后于90℃水浴中加热8h，过滤，滤渣晾干；④高温破坏：置120℃下放置10h。取上述滤渣加甲醇超声溶解并稀释至刻度，分别进样 20μL，照“4”项下色谱条件测定。

6 样品分析

取3批供试品，称取供试品约 25mg，精密称定，置50 mL 量瓶中，加适量甲醇超声 15 min，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，取 AOH对照品同法操作，得对照品溶液。取上述溶液 20 μL 注入液相色谱仪，按照“4”项下色谱条件测定，记录色谱图。批号20170301、20170302、20170303含量为0.68 mg/mg、0.69 mg/mg、0.71 mg/mg。

7 讨论

7.1 波长的选择

配制一定浓度的对照品溶液，在 190～800 nm 范围内进行全扫描（见图 3），可以看出本品为末端吸收，与AOH结构式中只有一个双键的特征相符合，选择 206 nm 作为检测波长，既保证主药能有相应吸光值，有关物质也在此波长处有较强吸收；流动相在该波长处无吸收，不会干扰被测组分。

图2 AOH冻干粉针专属性 HPLC 分析结果

7.2 AOH冻干粉针破坏实验

从破坏试验中可知，本品在高温、氧化、碱性和酸性条件下稳定。用检查有关物质的色谱条件，可以检查到过氧化氢氧化破坏、碱破坏、酸破坏、加热破坏后的降解产物。本品与降解产物能很好分离，色谱图见图2。说明所建立的HPLC方法专属性好，该色谱条件可用于AOH冻干粉的含量测定和有关物质的检查。

7.3 辅料的影响

冻干粉针中主药 AOH 不溶于水，可溶于有机溶剂，但辅料为水溶性，采用纯有机溶剂提取，这就大大减少了辅料对其干扰，由液相色谱图也可以进一步验证，空白辅料对测定无干扰。

8 结论

冻干粉针剂相对于水针剂质量更稳定，也更适合于给药剂量较小药物。作为一种新的辐射防护药物，AOH给药剂量小，对辐射有较好治疗作用，制成冻干粉针剂，不仅可以提高生物利用度，也可以相对降低潜在毒副作用，进一步增加了药物给药方式选择途径。本实验通过HPLC对冻干粉中AOH定量研究，经方法学研究结果表明，该方法简便、准确、重现性好、专属性强，可为AOH冻干粉针剂质量标准的制订提供可靠的依据。

[1] 胡秋菊,杨代晓,杨建云,等.GC-MS衍生化法测定大鼠血浆中内源性5-雄烯二醇及药动学研究[J].药物分析杂志 ,2016,36(6)：961-967.

[2] WHITNALL M H, ELLIOTT T B, HARDING R A,et al.Androstenediol stimulates myelopoiesis and enhances resistance to infection in gamma-irradiated mice[J].Int J Immun opharmacol,2000,22(1)：1-14.

[3] STICKNEY DR,DOWDING C,AUTHIER S,et al.5-Androstenediol improves survival in clinically unsupported rhesus monkeys with radiation-induced myelosuppressio[J]. Int Immunopharmacol,2007,7(4)：500-505.

[4] WHITNALL M H, VILLA V, SEED T M, et al. Molecular Specif i city of 5-Androstenediol as a Systemic Radioprotectant in Mice[J]. Immunopharmacology Immunotoxicology, 2005,27(1)：15-32.

[5] 丁桂荣,郭国祯.抗辐射损伤药物的研究现状[J].辐射研究与辐射工艺学.2007,25(6)：321-325.

[6] WHITNALL MH,INAL CE,JACKSON WE,et al.In vivo Radioprotection by 5-androstenediol：stimulation of the innate immune system[J].Radiat Res,2001,156(3)：283.

[7] GRACE MB,SINGH VK,RHEE JG,et al.5-AED enhances survival of irradiated mice in a G-CSF-dependent manner,stimulates innate immune cell function,reduces radiation-induced DNA damage and induces genes that modulate cell cycle progression and apoptosis[J]．Radiat Res,2012,53(6)：840.

[8] 石童,王陈,蒋辉,等.抗辐射生物药物的研究进展[J].国际药学研究杂志 ,2014,41(6)：658-662.

[9] 陈晓静,何杰,杨建云,等.RP-HPLC 法测定冻干粉针中DHEA 的含量[J].现代仪器与医疗,2015,21(6)：71-73.

[10] 国家药典委员.中华人民共和国药典（四部）[M].北京：中国医药科技出版社 ,2015： 374-377.