牙周炎与活性氧致病机制的研究进展

方慧 刘琪

[摘要] 近年研究认为，氧化应激的直接和间接参与也是导致牙周组织破坏的关键因素。活性氧（ROS）是机体氧化应激的产物，它已成为近年牙周炎发病机制的研究热点。生理水平的ROS能作为第二信使参与调控细胞内环境稳态、信号转导、凋亡等生理活动，而过量ROS则发挥细胞毒性，对蛋白质、脂质、DNA造成氧化损伤，干扰细胞生长和细胞周期进程，并诱导牙龈成纤维细胞凋亡。ROS的这些作用共同对牙周组织造成了不可逆转的直接损伤。此外，ROS还能通过激活炎性因子、核因子κB（NF-κB）、c-Jun氨基末端激酶（JNKs）及自噬改变牙周微环境而对牙周组织造成间接的严重破坏。本文概述了目前ROS的过量生成及其所激活的相关信号通路与牙周炎的关系，为进一步探索ROS与牙周炎发生发展的相关性提供依据。

[关键词] 牙周炎；活性氧；炎性因子；核因子κB；c-Jun氨基末端激酶；自噬

[中图分类号] R781.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）02（b）-0022-05

[Abstract] Recent studies suggest that the direct and indirect participation of oxidative stress is also a key factor in the destruction of periodontal tissue. Reactive oxygen species （ROS） is a product of oxidative stress in the body. It has become a hot research topic in the pathogenesis of periodontitis in recent years. Physiological levels of ROS can participate in physiological activities such as homeostasis， signal transduction and apoptosis in cells as second messengers. Excessive ROS play a cytotoxic role， causing oxidative damage to proteins ， lipids and DNA， interfering with cell growth and cell cycle progression ， and induce gingival fibroblast apoptosis. These effects of ROS together cause irreversible and direct damage to the periodontal tissue. In addition， ROS can also indirectly cause serious damage to periodontal tissues by activating inflammatory factors， nuclear factor κB （NF-κB）， c-Jun N-terminal kinases and autophagy. This article summarizes the relationship between the excessive production of ROS and its activated signal transduction pathway and periodontitis， so as to provide evidence for further exploration of the correlation between ROS and periodontitis.

[Key words] Periodontitis； Reactive oxygen species； Inflammatory factors； Nuclear factor-κB； C-Jun N-terminal kinases； Autophagy

牙周炎是一种常见的慢性感染性疾病，其特征是通过牙周病原菌的相互作用和宿主免疫反应导致牙周支持组织完整性遭到不可逆性破坏的炎性疾病。过去关于牙周炎的研究侧重于具有高蛋白酶和免疫抑制特征的宿主细菌的重要性，如牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.g），而近年研究认为，仅牙周病原菌对牙周的致病性是不够的，还涉及其他各类复杂的生物因子、信号分子和通路。大多数牙周组织的损伤是白细胞、补体和ROS参与的宿主固有免疫反应的联合效应。一般而言，生理水平的ROS具有抗菌、宿主防御和免疫調节作用，但过量的ROS则具细胞毒性，能对细胞的蛋白质、脂质和DNA造成氧化损伤[1]，干扰人牙龈成纤维细胞生长和细胞周期的进展[2]，诱导牙龈成纤维细胞凋亡等[3]，直接或间接诱导牙周组织损伤。本文概述了目前ROS的过量生成及其所激活的相关信号通路与牙周炎的关系，为进一步探索ROS与牙周炎发病及其进展的相关性提供依据。

1 ROS的来源及其与牙周炎的关系

1.1 ROS的来源

机体的大部分组织能连续产生ROS以参与细胞的正常生理代谢。ROS是氧自由基和参与氧自由基生成的其他非自由基氧衍生物的统称，它们都是寿命短而活性高的氧化产物。狭义的ROS主要包括过氧化物（O2—·）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（·OH）和单线态氧（1O2），广义上还包括活性氮（RNS），即一氧化氮（NO）、二氧化氮（NO2）和过氧亚硝基自由基（ONOO·）等。这些物质都是通过内质网（ER），线粒体电子传递链（Mito-ETC），过氧化物酶，如NADPH氧化酶（NOX）、黄嘌呤氧化酶（XO）、环氧合酶（COX）、脂氧合酶（LOX）等酶内源性生成的，而Mito-ETC通常被认为是ROS生成的主要途径[4]。在此过程中，电子给体（如NADH）通过氧化还原反应将电子传递给电子受体（如O2）合成三磷酸腺苷（ATP）。此期间电子可能泄漏至O2而生成ETC的副产品O2—·，随后通过超氧化物歧化酶1（SOD1/CuZn-SOD）在线粒体膜间隙或超氧化物歧化酶2（SOD2/MnSOD）在基质中歧化O2—·生成H2O2，而谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）或过氧化氢酶（CAT）能将H2O2还原成H2O，但在芬顿（Fenton）和Haber-Weiss反应中H2O2可部分降解为·OH[5]。

虽然机体为了维护氧化还原平衡也会形成大量抗氧化剂，如SOD、CAT、GPX、谷胱甘肽（GSH）、谷氧还蛋白和硫氧还蛋白体系等[6]，但ROS过量产生、抗氧化剂水平降低或抗氧化酶受抑制所诱导的氧化应激，能诱发一系列炎症疾病，如癌症、心血管疾病、糖尿病以及近年来证据日渐增多的牙周炎[7]。

1.2 ROS与牙周炎的关系

研究认为，过量生成的ROS及机体抗氧化防御系统失衡是导致细胞毒作用和加剧牙周组织破坏的原罪[8]。临床研究显示，牙周炎患者的血漿和血清总抗氧化剂（TAOC）及特异性抗氧化剂如SOD、CAT和GPX水平均较对照组显著降低[9]。与对照组相比，慢性牙周炎患者龈沟液中抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）的浓度较低，在洁治和根面平整术后其水平显著升高[10]。唾液是公认的牙周炎标志物池[11]，其中的氧化剂和抗氧化剂水平能在一定程度上反应牙周局部的氧化应激状态。临床研究显示，与对照组相比，牙周炎患者唾液中TAOC水平显著降低，氧化损伤标志物水平明显高于对照组，并与社区牙周治疗需要指数（CPITN）呈负相关，但唾液总抗氧化能力（TAC）与牙周炎状态呈正相关[12]。此外，牙周炎患者的血清、唾液和龈沟液（GCF）中均发现较对照组更高的ROS代谢物和总氧化剂（TOS），且唾液和血清氧化应激水平、丙二醛（MDA）水平也显著升高，TAC却降低[13]。这预示着牙周炎患者并发全身和局部炎性疾病的风险急剧增加。ROS浓度较低时，能刺激体外培养的人牙周膜成纤维细胞（HPDLFs）增殖和分化；当其浓度较高时，则兼具杀伤病原体和对周围组织的细胞毒作用，导致牙周组织破坏加剧[14]。Cavalla等[15]的研究显示，ROS能增加明胶溶解性基质金属蛋白酶（MMPs）的活性，刺激人牙周膜成纤维细胞（HPDLFs）分泌细胞因子（IL-1β、IL-6等），从而加剧牙周组织破坏。此外，ROS能下调成骨细胞分化和刺激破骨细胞发生，促进骨丢失[16]。

2 过量ROS促进牙周炎发生发展的机制

2.1 活化炎性介质

炎性小体（inflammasomes）是位于细胞胞质内的多蛋白复合物，作为对细胞感染、应激或组织损伤的应答，炎性小体被组装为炎性复合体（inflammasome complex）而被激活，促进炎性反应并参与宿主防御和疾病的病理过程，它能感知表示细胞内稳态丧失的产物和内源性信号，在牙周炎和几种全身性疾病中都很活跃[17]。细胞因子IL-1家族的加工是由细胞内固有免疫应答系统调节，称为域蛋白（NLRP3/NALP3）炎性复合体，它是一种代谢危险传感器，是目前最完整的炎性复合体，由NLRP3支架、衔接蛋白凋亡相关斑点状蛋白（ASC）和半胱天冬酶（caspase）-1组成[18]。在静息细胞中，硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）与硫氧还蛋白（TRX）相结合，当细胞内ROS增加即可氧化TRX，促使TXNIP从TRX释放而与NLRP3炎性体结合并将其激活，抑制ROS的活性则可抑制这种结合，从而使NLRP3炎性体失活[19]。这说明ROS的生成是NLRP3炎性体激活的必需上游事件，它能“点燃”激活NLRP3炎症体及导致相应病理过程的效应分子。随后，现有和/或新合成的NLRP3炎性体激活caspase，主要是caspase-1，后者通过特异性切割无活性的pro-IL-1β和pro-IL-18，将二者转化为具有生物活性的IL-1β和IL-18，并介导它们的成熟和释放，从而启动宿主固有免疫应答[20]。研究发现，与对照组相比，牙周炎患者牙龈组织中的NLRP3水平显著升高，IL-1β水平也相应增加；而使用ROS清除剂抑制ROS活性后，即可阻止NLRP3炎性体活化和降低IL-1β水平[19]。在牙周炎患者的龈沟液和牙龈组织中，NLRP3炎性体的含量和活性均增加，从而导致caspase-1的活化及IL-1β的分泌增加[21]。牙龈上皮细胞（gingival epithelial cells）中ROS的过量产生激活了NLRP3炎症体和caspase-1，从而促进IL-1β的分泌[21]。牙周组织受感染、应激或损伤的细胞不断生成ROS，通过激活NLRP3炎性体而导致促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6等的持续分泌和积累，从而引起炎症性喷发，加剧牙周组织的破坏[19]。综上所述，NLRP3炎性体可作为炎症信号的平台，通过NLRP3—caspase-1—细胞因子通路参与牙周组织的固有免疫反应引发和/或加剧牙周炎，导致牙周组织的不可逆性破坏。

2.2 激活NF-κB通路

虽然牙周炎是微生物菌斑引发的慢性炎症性疾病，但遗传和牙周局部微环境都有助于牙周炎的发生发展。转录因子是基因特异性因子，常作为遗传和环境因素之间的联系。NF-κB是第一个被证实响应ROS的转录因子，当细胞内ROS被清除后，NF-κB的活性即被消除[22]，而其被激活后则能协调多种炎症因子的表达。临床研究显示，与对照组相比，NF-κB在牙周炎受试者中高度活化，活化的NF-κB能增强促炎细胞因子（如IL-6、IL-1β、TNF-α）和趋化因子（如IL-8）分泌，从而触发炎性反应和破骨细胞分化，导致牙周组织破坏[23]。这些炎性细胞因子除了能促进牙周局部的炎性反应，也能调控NF-κB配体的受体激活剂（RANKL）和骨保护素（OPG）的表达，而RANKL和OPG被认为是骨代谢的主要调节剂，所以二者也被认为是牙周炎时牙槽骨破坏机制的关键[24]。研究证实，牙周炎使牙周组织中RANKL过表达能促进牙槽骨吸收，而保护牙槽骨免遭吸收的OPG水平则显著降低，从而间接促进牙槽骨吸收[25]。受损牙周细胞生成的过量ROS激活NF-κB后，通过介导IL-6、IL-1β等一众细胞因子过表达而调控RANK/RANKL/OPG通路上调破骨细胞活性，导致牙根严重吸收、牙槽骨高度逐步丧失、牙齿过早剥落以及牙周动态平衡和牙槽骨重构紊乱，并且还可通过RANK非依赖途径诱导牙槽骨丢失[24]。趋化因子IL-8对中性粒细胞（PMNs）有明显的靶向特异性，能在炎症部位募集并激活PMNs，活化的PMNs通过释放酶原颗粒和ROS能有效降解牙周结缔组织成分，同时，内皮细胞也被大量持续渗出的PMNs聚集而遭继发性损害[26]。因此，IL-8能协同IL-6和IL-1β等细胞因子破坏牙周组织。另外，研究证实[27]，NF-κB作为NALP3炎性体形成的次级信号分子，能启动NLRP3炎症体。Yoshida等[28]的研究证实，在牙周炎时，NF-κB通过调节NLRP3炎症体的表达来调节牙周炎症。

2.3 激活JNK通路

被稱为应激活化蛋白激酶（SAPKs）的JNKs可被多种胞外刺激激活（生长因子、细胞活素类、氧化应激等），诱导不同细胞系发生凋亡。近年研究表明，牙周炎时过量ROS能激活JNK信号通路。研究发现，尼古丁可诱导人牙龈成纤维细胞（HGFs）产生过量ROS，并接受较短时间刺激后即可检测到水平较高的磷酸化JNK，其浓度随时间的延长逐步降低；随后，线粒体发生结构和功能的变化而释放细胞色素C（Cyt-c），激活caspase-3和caspase-9级联反应诱导HGFs凋亡[29]。另外，ROS激活JNK通路也可诱导炎性细胞因子的生成和释放。P.g能在牙龈上皮细胞诱导产生过量ROS后激活JNK通路，并在活化的JNKs介导下上调IL-1β和IL-6的表达，造成上皮细胞损伤而加剧牙龈炎症，抑制ROS的生成即可抑制JNK通路活化，从而阻止炎性细胞因子释放[30]。但是，上述情况都需要ROS持续激活JNK通路。Nakano等[31]的研究认为，ROS可以利用两种不同的机制来调控JNK的持续活化：ROS通过激活MAPKKK导致JNK活化和/或灭活，从而诱导JNK去磷酸化的ROS抑制MAP激酶磷酸酶（MKPs）。另外，他们也推测caspase级联反应的激活也能反过来激活JNK通路。

2.4 启动自噬

自噬（autophagy）是进化上保守的细胞内降解系统将损伤或多余的细胞材料如受损的细胞器、变性的蛋白质和细菌等递送至溶酶体，为新的合成或能源产生而将各材料降解[32]。近年研究证实，线粒体ROS是调节自噬的重要信号分子。过量生成的ROS可通过靶向自噬相关基因（Atgs）和/或上游信号通路如雷帕霉素复合物1（mTORC1）、Beclin1和Atg12-Atg5复合物等的哺乳动物靶标来调节自噬活性[33]。就目前的研究发现而言，ROS至少可通过四种不同机制调节自噬[33]：①激活JNKs后磷酸化Bcl-2，导致Beclin 1解离和自噬诱导；②激活PI3K-AKT通路导致mTOR活化，使其发挥自噬诱导抑制剂的作用；③依赖AMPK抑制TORC1活性，利于激活自噬；④激活Atg12-Atg5复合物促进自噬延长。

新兴证据表明，牙周炎患者牙周细胞线粒体产生的过量ROS可激活牙周组织的自噬作用。用LPS处理HGFs后发现，Atg12和微管相关蛋白I轻链3（MAP-LC3）的蛋白及转录基因的表达均增加，并与牙周炎患者外周血单核细胞线粒体产生的ROS呈正相关，当线粒体产生的ROS减少，自噬也随之减少[34]。这表明自噬参与牙周炎症的调控，自噬对牙周炎有双重作用，能促进细胞死亡或抑制感染细胞凋亡[35]。首先，自噬可能是牙周炎时细胞死亡的一种模式。由牙周厌氧菌生成和释放，随后被龈下成熟菌斑高度浓缩的丁盐酸在牙龈上皮细胞启动自噬而导致细胞死亡[36]。其次，自噬可能阻断凋亡诱导的细胞死亡并保持细胞在牙周炎症微环境中的生存能力。研究发现，当自噬被抑制时，牙周炎患者外周血单核细胞凋亡增加，细胞活力下降[34]。用自噬的抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MeA）作用于LPS处理过的HGFs，发现自噬受抑制，随后出现细胞活力下降且细胞凋亡百分率增加[35]。牙周炎患者的牙周组织和牙周膜干细胞（PDLSCs）的体外实验也表明，牙周炎时自噬的激活可能保护细胞免于凋亡[37]。上述都说明自噬在牙周炎时对细胞有一定的保护作用，并且自噬和凋亡在牙周炎中是共存的，推测这是牙周炎时自噬和凋亡的信号串扰所致，而究其根本可能是二者的上游调节因子之间相互作用的结果。因此，细胞凋亡与自噬之间的复杂关系可能是牙周炎发病机制的重要因素之一。再次，牙周病原菌也能调节牙周组织的自噬作用。P.g可利用自噬增强其渗透并定植于宿主牙周组织，内化后P.g可诱导自噬，抑制感染宿主细胞凋亡，导致牙周微环境有利于其复制和逃避宿主防御系统[38]。Cho等[39]的研究还报道了P.g的细胞内侵袭在感染细胞中诱导自噬，并通过G1细胞周期停滞来抑制细胞增殖。此外，据报道P.g位于早期内涵体内，大约一半的内化生物体被分选到裂解室，包括自噬体[40]，而相当数量的特定内涵体内剩余的细胞内病原体可以调节受感染细胞的细菌出口，导致它们能进一步渗透至牙周组织[41]。总之，自噬能通过介导P.g的存活、复制和传播影响牙周炎的发病和进展。综上所述，自噬可能通过以下机制参与牙周炎的发生发展：①调节免疫信号，导致炎性疾病和牙周组织损伤；②保护牙周细胞免于凋亡；③调节牙周病原菌的入侵。

3 小结和展望

大量研究证据表明，生理水平的ROS可以作为激活对牙周组织有益的应激反应的信号分子，但过量的ROS和/或抗氧化缺陷则会导致牙周组织的氧化损伤和功能障碍。本文梳理了目前已证实的几种ROS对牙周炎发病和促进疾病发展的机制，一来旨在从这一角度对牙周炎的发病机制和病程进展有个总体认识，二来希望能对未来关于这一方面的研究有所助益。未来我们还需深究局部和系统性氧化还原状态在牙周炎的作用机制，并利用这些研究成果研发新药或尝试用于临床治疗，以确定针对氧化应激的特异性干预是否有益于临床疗效。

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