水貂犬瘟热病毒RC01株和细小病毒RC02株的分离鉴定及攻毒保护试验

赵益超 糜 飞 张 伟 （国药集团扬州威克生物工程有限公司 江苏 杨州 225100）

水貂犬瘟热、病毒性肠炎是目前危害水貂养殖业发展最严重的急性病毒性传染病，给养貂行业造成了巨大的经济损失，严重影响着我国养貂等毛皮动物养殖业的发展。水貂犬瘟热和病毒性肠炎在临床上尚无特效疗法，防治本病主要以定期注射疫苗为主。

水貂犬瘟热由犬瘟热病毒(CDV，RNA病毒)引起，首先由Rudolf于1928年发现，1973年我国黑龙江省首次报道了水貂犬瘟热的流行，以后逐渐蔓延至全国。水貂犬瘟热是我国当前养貂业中危害最大的疾病，由于该病经常引起混合感染和继发感染，有“毁灭性传染病”之称[1,2]。水貂病毒性肠炎由病毒性肠炎病毒(MEV, DNA病毒)引起的以水貂胃肠粘膜炎症为主要特征的急性病毒性传染病。1947年本病首次发生于加拿大安大略州的威廉堡地区，到1949年Schofieldsh首次报道并将其命名为MEV[3,4]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 疑似CDV、MEV混合感染水貂病料，由国药集团扬州威克生物工程有限公司于2017年7月采自山东荣成某农户水貂养殖场。

1.1.2 细胞及毒株 传代系细胞：Vero-KL39、F81-KL细胞均由国药集团扬州威克生物工程有限公司保存和提供。毒株：犬瘟热病毒CL08株、细小病毒RM-C株均由国药集团扬州威克生物工程有限公司保存和提供。

1.1.3 阳性血清 兔抗犬瘟热病毒阳性血清中和抗体效价≥1：9000；兔抗病毒性细小病毒阳性血清HI效价≥1：50000均由国药集团扬州威克生物工程有限公司制备、保存和提供。

1.1.4 主要试剂和仪器 DMEM培养基、胎牛血清、1%猪红细胞、胰蛋白酶-EDTA消化液、倒置显微镜、CO2细胞培养箱、0.22μm微孔除菌过滤器、PCR仪器均由国药集团扬州威克生物工程有限公司提供；RNA提取试剂盒子、反转录试剂盒购自TaKaRa。

1.2 方法

1.2.1 病料的采集和处理 将采集的病料(肺脏和肠管)分别按重量比1：10加入无菌PBS(pH7.2)匀浆处理，-20℃连续冻融3次，10000rpm离心10min，取上清，以无菌PBS稀释5倍后0.22μm微孔除菌过滤，各分成4份-20℃保存，分别用于CDV和MEV的RT-PCR检测、Vero-KL39和F81-KL细胞接种病毒分离、犬瘟热病毒胶体金快速检测卡和对猪红细胞血凝(HA)检测、备份。

1.2.2 犬瘟热及细小病毒的快速检测 将分装的肺脏和肠管病料研磨液分别按犬瘟热病毒胶体金快速检测卡说明进行检测CDV，以出现“C”线表示试验成立，“C”和“T”同时出现表示病料存在犬瘟热病毒，若仅出现“C”线表示不存在犬瘟热病毒。同时，将上述两种病料研磨液参考《中国兽药典》附录测定研磨液对猪红细胞的HA，以出现血凝假定存在细小病毒。

1.2.3 犬瘟热病毒PCR鉴定 参考文献[5]设计用于鉴定CDV的N基因引物，利用巢氏RT-PCR鉴定。F1：5’-ATTT GGGATTGCTTAGGA-3’、R1：5’-GGCGCTCATCTTGGA CAT-3’，F2：5’-GTTAGCTAGTTTCATCCT-3’、R2：5’-G GTCCTCTGTTGTCTTGG-3’，按RNA提取试剂盒说明书提取RNA并反转录成cDNA。先以引物F1/R1进行第一次扩增，再用F2/R2进行第二次扩增，PCR反应程序均为94℃预变性3min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，扩增30个循环，最后72℃延伸7 min，最终扩增的目的片段为419 bp，电泳鉴定。

1.2.4 细小病毒鉴定 参考GenBank上细小病毒VP2基因保守序列(序列号：M24003.1)设计片段大小为1740bp，引物序列为：F3：5‘-ATGAGTGATG GAGCAGTT-3’、R3：5‘-AGGTGCTAGTTGAGAT TTTT-3’。按DNA提取试剂盒说明书提取DNA，以F3/R3引物进行PCR鉴定，PCR反应程序为参考1.2.3项PCR反应程序进行鉴定。

1.2.5 研磨液病毒含量的测定 按现行《中国兽药典》附录进行，取0.22μm微孔滤器除菌的肺脏和肠管样品，用无血清的DMEM进行10倍倍比稀释，接种96孔细胞培养板(含F81-KL细胞或Vero-KL39细胞)，0.1ml/孔，各稀释度6孔重复，FBS终浓度为1.0%，另设阴性、阳性对照各6孔。置37℃、含5%CO2细胞培养相中培养。第4日，接种F81-KL的细胞板按《中国兽药典》附录进行测定各样品对1%猪红细胞的血凝性，按照Reed-Muench法计算MEV的滴度；第5日，接种Vero-KL39的细胞版以倒置显微镜观察细胞病变，阳性病变应呈“蛛网样”病变，按照Reed-Muench法计算CDV的滴度。

1.2.6 病毒空斑纯化 取无菌处理的肺脏研磨液，根据1.2.5项测定的MEV滴度，将毒种稀释至毒液中含MEV 200TCID50/0.1ml，与兔抗MEV阳性血清各200μl混合，37℃孵育1h中和MEV后参考[6]常规方法在Vero-KL39上进行蚀斑克隆纯化三次，选择滴度较高的克隆株经PCR鉴定无误后定为CDV-RC01株F1代。取无菌处理的肠管研磨液，根据1.2.5项测定的CDV滴度，将毒种稀释至毒液中含CDV 200TCID50/0.1ml，与兔抗CDV阳性血清等体积混合，37℃孵育1h中和后参考[6]常规方法在F81-KL上进行蚀斑克隆纯化三次，选择滴度较高的克隆株经PCR鉴定无误后定为MEV-RC02株F1代。

1.2.7 病毒回归试验 将纯化后的毒种(CDV-RC01株和MEV-RC02株)的病毒原液分别接种12～15周龄健康易感貂(抗CDV中和抗体≤1：4、抗MEV HI抗体≤1：10)，各4只，2.0ml/只；同时设2只对照貂，接种等量PBS。接种后连续观察14d。犬瘟热病毒攻毒组：主要监测体温、精神状态、食欲、仔细观察鼻镜和眼睑及肠管棉拭子排毒情况。细小病毒攻毒组：主要监测体温、精神状态、食欲、仔细观察排粪情况及粪便对猪红细胞的HA。

1.2.8 免疫攻毒试验 将本公司中试生产的“水貂犬瘟热(CL08株)、病毒性肠炎(NA04株)二联活疫苗”按其说明书稀释至1头份/只，用14～17周龄(该二联疫苗效力检验应为9～10周龄貂，但因试验动物的特殊性，试验期间已无合适周龄的水貂，故以14～17周龄貂代替)健康易感貂16只，随机分成4组，4只/组，编号为A～D组。（1）犬瘟热部分：A组貂腿部皮下免疫本公司二联疫苗，1头份/只，B组免疫等量PBS作对照组。免疫后21d，所有貂腿部肌肉注射CDV-RC01株病毒原液，2.0ml/只。攻毒后主要监测体温、精神状态、食欲、仔细观察鼻镜和眼睑及肠管棉拭子排毒情况。（2）细小部分：C组貂腿部皮下免疫本公司二联疫苗，1头份/只，D组免疫等量PBS作对照组。免疫后14d，所有貂腿部肌肉注射MEV-RC02株病毒原液，2.0ml/只。主要监测体温、精神状态、食欲、仔细观察排粪情况及粪便对猪红细胞的HA。上述2种病毒攻毒后以出现死亡或2种以上上述症状判定为发病。

3 结果与分析

3..1 病料的初步鉴定

对采集的肺脏、肠管研磨液分别采用犬瘟热病毒胶体金快速检测卡进行快速检测，同时测定研磨液对猪红细胞的凝集价，结果显示，肺脏和肠管研磨液犬瘟热胶体金检测卡均显示阳性；肺脏和肠管研磨液对猪红细胞凝集价分别为2log2和4log2。表明，采集的病料内同时存在犬瘟热病毒和肠炎病毒。

3.2 PCR鉴定

分别提取肺脏研磨液的RNA及肠管研磨液的DNA，RNA样本经反转录后检测犬瘟热病毒，DNA样本检测细小病毒，结果显示，肺脏研磨液中成功检测出犬瘟热病毒的特异性目的条带，肠管研磨液成功检测出细小病毒的特异性目的条带，将目的条带纯化后测序鉴定结果显示均为目的条带。

3.3 病毒含量测定

测定肺脏和肠管研磨液的病毒含量，结果显示，肺脏研磨液CDV含量为106.5TCID50/0.1ml、MEV病毒含量为102.0TCID50/0.1ml；肠管研磨液CDV含量为103.5TCID50/0.1ml、MEV病毒含量为104.25TCID50/0.1ml。F81-KL细胞和Vero-KL39细胞分别接种MEV和CDV均出现典型的CPE，且MEV无法致使Vero-KL39细胞发生病变，CDV无法致使F81-KL细胞发生病变，研磨液中存在两种病毒含量差异较大，可以进行蚀斑纯化。

3.4 病毒纯化

将肺脏研磨液原液与兔抗MEV阳性血清孵育，将肠管研磨液稀释16倍后与兔抗CDV阳性血清孵育，分别在F81-KL和Vero-KL3细胞上进行连续3代空斑纯化，最终将分离的毒种分别命名为CDV-RC01株和MEV-RC02株(表1)。

表1 病毒纯化结果

3.5 回归试验

将分离的CDV-RC01株和MEV-RC02株分别接种健康易感貂，结果显示，CDV-RC01株攻毒组攻毒后水貂表整体表现体温升高、精神不振、食欲减退、鼻镜或眼睑干燥并表现排毒行为，部分貂鼻流出水样分泌物并死亡(表)。剖检可见肺脏成严重病变。MEV-RC02株攻毒组攻毒后表现体温升高至40℃以上并持续2-6日、精神沉郁、食欲不振、腹泻、粪便HA不低于1：128，部分貂发生死亡(表2～3)。试验设置的对照组观察期间一切正常。

表2 CDV-RC01株攻毒结果

表3 MEV-RC02株攻毒结果

3.6 攻毒保护试验

将“水貂犬瘟热(CL08株)、病毒性肠炎(NA04株)二联活疫苗”按使用剂量免疫健康易感貂，免疫后14d，进行MEV-RC02株的攻毒保护试验；免疫后21d，进行CDVRC01株的攻毒保护试验。试验结果显示，MEV-RC02株攻毒组，对照组4/4发病，免疫组4/4保护；CDV-RC01株攻毒组，对照组4/4发病，免疫组4/4保护。

4 讨论

（1）2017年6月，山东荣成某水貂养殖场发生一种急性、高度接触性传染病，主表现为发热、呕吐和腹泻，粪便有一定腥臭味等，仔貂死亡率高达80%。剖检肺脏可见淤血，胃、肠管黏膜充血等。以犬瘟热抗原试制条进行快速检测养殖场水貂，结果显示幼龄水貂检测呈阳性；肠管棉拭子对猪红细胞HA为4log2，表明可能同时伴有细小病毒感染，为进一步确诊，采用PCR和RT-PCR法进行检测。因犬科动物犬瘟热病毒和细小病毒具有高度的同源性，因此本实验采用国内外公开发表的通用引物作为检测引物进行检验。所建立的PCR和RT-PCR方法特异性强灵敏度高，成功检测出肺脏和肠管病料中同时携带CDV和MEV。将病料的研磨液分别接种CDV和MEV的敏感细胞，均出现典型的CPE。（2）为纯化毒株，将肺脏和肠管研磨液无菌处理后，分别接种Vero-KL39和F81-KL测定研磨液中的CDV和MEV的病毒含量，结果显示，肺脏研磨液中CDV含量远高于MEV，而肠管研磨液中MEV含量远高于CDV。将肺脏研磨液与抗MEV阳性血清中和后接种Vero-KL39细胞以扩增CDV，同时将肠管研磨液与抗CDV阳性血清中和后接种F81-KL细胞以扩增MEV。将初步纯化后的毒种再进行蚀斑纯化并分别命名为CDV-RC01株和MEV-RC02株。（3）将纯化出的CDVRC01株和MEV-RC02株毒种分别回归本动物，结果显示，CDV-RC01株和MEV-RC02株回归本动物后成功复制出典型临床症状。表明，分离的CDV-RC01株和MEVRC02株均具有较强的致病性。（4）为检验国药集团扬州威克生物工程有限公司新研发的“水貂犬瘟热、病毒性肠炎二联活疫苗(CL08株+NA04株)”对野毒的保护力，特进行免疫攻毒试验，结果显示，该疫苗对分离的野毒具有很好的保护作用。

本试验通过结合临床症状和HA、PCR、RT-PCR和特征性CPE等多种方法确诊犬瘟热和细小病毒混合感染，同时采用阳性血清中和后接种敏感细胞进行蚀斑纯化，成功分离一株CDV和一株MEV并对分离株的致病性进行检测。为进一步研究水貂CDV和水貂MEV提供了基础。

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