利用基因工程技术构建人WWP2基因的真核表达载体*

雷子宸 刘 姿 马 亮

(1安徽省马鞍山市第二中学；2安徽工业大学化学与化工学院 安徽马鞍山 243000)

肺癌是世界上致死率最高的癌症之一，成为威胁人类健康的主要杀手[1]。中国的肺癌位居恶性肿瘤死亡和发病的首位，每年约59.1万人死于肺癌[2]。按组织学分型，肺癌可分为非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer， NSCLC)和小细胞肺癌(small-cell lung cancer， SCLC)，其中NSCLC约占85%，包括肺腺癌、鳞癌和大细胞癌。放化疗或组合治疗是目前肺癌治疗的主要方式，虽然目前肺癌的治疗取得较大进展，但由于耐药性的出现，导致肺癌的预后仍然较差，5年生存期小于15%[3-4]。随着现代医学的发展，肺癌的靶向治疗成为一种有前景的治疗手段，靶向治疗药物因具有特异性抗肿瘤作用和副作用小等优点，在NSCLC化疗中受到广泛重视，目前已有多种分子靶向药物应用于临床，如靶向EGFR和ALK两个重要的NSCLC肿瘤驱动基因的分子靶向药物，均取得显著成效，使患者免受传统化疗手段带来的痛苦[5-6]。

人WWP2(含有E3泛素蛋白连接酶2的WW结构域)，也被称为AIP2(Atrophin-1蛋白相互作用蛋白2)，首先是由Pirozzi等在筛选包含WW结构域蛋白的过程中发现的，位于染色体16q21.1，是一个多功能的泛素连接酶。WWP2含有870个氨基酸，由C2、WW和HECT结构域组成，N端C2结构域参与膜结合，C末端HECT结构域起到泛素连接酶作用，WW结构域主要起到识别靶蛋白作用[7]。越来越多的证据表明，WWP2在癌症中起着重要的作用。例如目前已有报道WWP2在口腔癌中高表达，可作为潜在的口腔癌进展以及预后的标志物或治疗靶点[8]；其他研究显示WWP2与PTEN，Smads和Oct4等相互作用，并介导其通过泛素蛋白酶体通路降解，参与肿瘤细胞的生长、存活和肿瘤转移等[9-10]。因此，WWP2有望成为未来肿瘤治疗的新靶点。但迄今为止，WWP2蛋白在肺癌中的功能以及能否作为肺癌治疗的新靶点等还远未阐述清楚，文章的研究目的是利用基因工程技术实现人WWP2基因真核表达载体的构建及表达，为进一步研究WWP2蛋白的功能以及作为肺癌治疗靶点的可行性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验材料 人胚肾细胞HEK293T细胞购自中国科学院细胞库。大肠杆菌TOP10购自北京康为世纪生物科技有限公司。pcDNA3.1-Flag载体由安徽工业大学与化工学院实验室保存。

1.1.2试剂 高保真PrimeSTAR HS DNA聚合酶、T4 DNA 连接酶、rTaq酶、限制性内切酶EcoRI、XhoI，DNA marker，TaKaRa公司；琼脂糖，国药集团化学试剂有限公司；高纯度质粒小提试剂盒(Pure Plasmid mini Kit)、DNA凝胶回收试剂盒，Axygen；GoldviewⅡ型核酸染料，北京索莱宝科技有限公司；Lipofectamine 2000，Invitrogen公司；高灵敏度化学发光试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司；Tryptone 胰蛋白胨、Yeast extract 酵母提取物、Agar 琼脂粉，Vetec；DMEM培养基、胎牛血清，Hyclone；蛋白质预染Marker，Thermo Fisher；抗Flag抗体，Cell Signaling Technology；抗Actin抗体，Sigma；羊抗兔、羊抗鼠二抗，Santa cruz biotechnology；PCR引物，南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.1.3仪器 PCR仪、CO2培养箱、﹣80冰箱、台式微量高速离心机，Thermo Fisher；GelMax Imager System 成像系统，美国UVP；电泳仪、垂直电泳仪、转移电泳槽，上海天能科技有限公司；核酸电泳仪，Bio-Rad；HH-4数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司。

1.2 方法

1.2.1引物设计与合成 在NCBI网站上找到WWP2基因的CCDS序列(2613bp)，按照引物设计的原则，使用Primer5.0设计引物，设计的引物有：①正向引物：5'- GGAATTCATGGCATCTGCCAGCTCTAG-3'(5'含有EcoRI酶切位点);②反向引物：5'- CCGCTCGAGTTACTCCTGTCCAAAGCCCTC-3'(5'含有XhoI酶切位点)。

1.2.2 Flag-WWP2重组质粒的构建 以肺癌细胞A549的cDNA为模板，根据上述设计的引物，通过PCR技术扩增WWP2基因的编码序列，PCR体系包括：5× PrimeSTAR Buffer (Mg2+ Plus) 5 μL，dNTP mixture(2.5mM) 4 μL，正向引物 1 μL，反向引物 1 μL，模板 1 μL，Prime STAR HS DNA 0.5 μL，加灭菌水补充至50 μL。PCR程序如下：95℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸3 min，30个循环；72℃延长10 min。PCR反应结束后，琼脂糖凝胶(0.8%)电泳检测反应产物，并用胶回收试剂盒回收PCR产物。

将回收后的目的片段和pcDNA3.1-Flag空载体都用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，然后通过T4 DNA连接酶将两个酶切片段连接，然后转化感受态菌株TOP10，挑选阳性克隆，进行小量培养，最后从菌液中提取质粒。

对获得的重组质粒先通过酶切法、PCR法进行鉴定，然后选取正确的质粒通过测序(南京金斯瑞生物科技有限公司)进一步验证所构建质粒的正确性。

1.2.3细胞转染和免疫印迹法检测 Flag-WWP2重组质粒在细胞中的表达 以Lipofectamine 2000为转染试剂，按照说明书的操作方法进行重组质粒的转染。将HEK293T细胞消化后接种于6孔板中，用无双抗的DMEM培养基培养，放置CO2培养箱中培养过夜至细胞密度90%左右进行转染。将5 μL Lipofectamine 2000加入250 μL Opti-MEM中混合静置5 min，再将2 μg质粒(重组质粒或空载体质粒)与250 μL Opti-MEM混合，然后将上述两种溶液混合，室温静置20 min后将混合液逐滴加入含有500 μL无双抗无血清DMEM的细胞中，培养6 h后换成新鲜的DMEM完全培养基。转染48 h和72 h后用RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)提取总蛋白质。

提取的蛋白质通过考马斯亮蓝染色法进行相对定量，将等量的蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离，通过湿转法将胶上的蛋白质印迹到硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，NC膜)上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，然后一抗孵育，4℃过夜，TBS-T洗4次后，孵育相应的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温摇床孵育2 h，TBS-T洗后，化学发光法显色5-10 min，压片显影和定影。

2 结果

2.1 pcDNA3.1-Flag-WWP2重组质粒的构建

以实验室已有的肺癌细胞A549的cDNA为模板，PCR法扩增人WWP2基因的编码序列，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对比DNA Marker出现约2600bp大小的目的基因条带，与预期的片段大小一致，表明目的基因体外扩增成功(见图1)。将PCR产物和空载体pcDNA3.1-Flag都分别用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，形成粘性末端，连接酶切后的目的片段和空载体片段，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，在抗性平板上挑取单克隆进行菌液培养并提取质粒。

图1 人WWP2基因的PCR产物琼脂糖电泳图谱

2.2 pcDNA3.1-Flag-WWP2重组质粒的鉴定

为了验证所获质粒的正确性，文章先通过双酶切法和PCR法进行鉴定。双酶切结果如图2A所示，双酶切后出现两条约为5400bp和2600bp的条带，线性化空载体的大小约为5400bp，目的基因为2613bp，说明插入序列正确，酶切结果与预期一致，重组质粒pCDNA3.1-Flag-WWP2初步构建成功。进一步将重组质粒进行PCR鉴定，结果如图2B所示，扩增出的条带约为2600bp，与WWP2基因的大小一致。随后的测序结果如图2C所示，左图为NCBI网站中BLAST进行序列比对的图，右图是部分序列的峰图，重组质粒的序列和WWP2基因的编码序列完全匹配，表明pcDNA3.1-Flag-WWP2重组质粒构建成功，可用于后续实验。

图2 重组质粒pcDNA3.1-Flag-WWP2的EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切电泳图(A)；PCR鉴定电泳图(B)；测序结果图(C)

2.3 pcDNA3.1-Flag-WWP2重组质粒在人胚肾HEK293T细胞中的表达

为了进一步验证重组质粒能否在真核细胞中表达，将所构建的pcDNA3.1-Flag-WWP2质粒和空载体分别转入人胚肾细胞HEK293T中，分别于转染48h和72h后提取蛋白质。免疫印迹结果如图3显示示，转染重组质粒后，用Flag抗体能够在相对分子质量约100kDa处检测到明显的特异性条带，空载体无条带，说明pcDNA3.1-Flag-WWP2重组质粒在HEK293T细胞中能够正确表达。

图3 免疫印迹检测pcDNA3.1-Flag-WWP2重组质粒的表达

3 讨论

基因工程又称为DNA重组技术或者基因拼接技术，指将一个生物体得到的目的基因与空的质粒载体在体外用合适的酶进行重新连接，进而转化进入受体细胞中，可以让其遵循人们的意愿进行稳定的克隆或者表达，从而产生出新的产物或者新的性状。该技术具体分为以下几个步骤：①目的基因的分离与克隆；②利用工具酶进行基因表达载体的构建；③重组载体导入受体细胞及在细胞中的表达；④目的基因表达产物的分离纯化与鉴定。文章拟通过基因工程技术构建人WWP2基因的真核表达载体，为后续的深入研究该基因在癌症中的功能奠定基础。

文章所研究的WWP2基因是泛素-蛋白酶系统中的E3连接酶，近几年该基因在癌症中的研究越来越受到重视。研究报道，WWP2蛋白在口腔癌、子宫内膜癌、肝癌和肺癌中高表达，且通过调节PTEN的降解发挥促癌作用[8-11]。进一步的功能研究显示，干扰WWP2的表达能抑制肝癌细胞Huh7和BEL-7404及肺癌细胞A549和SPC-A-1的生长、侵袭和迁移能力。研究结果提示，WWP2蛋白在癌症的发生发展中起着重要作用，且有可能作为潜在的癌症治疗靶点[10-12]。但WWP2在肺癌中的功能和分子机理远未阐述清楚，因此，该研究采用基因工程技术，成功构建了带Flag标签的WWP2真核表达载体，并能在细胞中表达，可为深入研究WWP2蛋白的功能及作为肺癌治疗靶点的可行性奠定基础。

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