重组人血管内皮生长抑制因子对人肺腺癌裸鼠移植瘤的放射效应影响*

程小峰,高春玲,谈文娟，王笑良，张蓓蓓，张娇，章志勇

361001 福建 厦门， 厦门大学附属成功医院(中国人民解放军第174医院) 放射治疗科(程小峰、高春玲、王笑良、张蓓蓓、张娇、章志勇) 361001 福建 厦门, 厦门大学医学院(谈文娟)

血管内皮抑制因子(VEGI)是一种新型的抗血管生成抑制剂，能够凋亡增殖的血管内皮细胞，抑制新生血管形成。VEGI主要由血管内皮细胞和树突状细胞分泌，为多功能性小分子蛋白，发挥抑制新生血管形成的功能[1-2]。VEGI 有3种同工型， 最早发现的VEGI-174, 又称为TL1， 后来又发现了由全长基因序列编码的VEGI-251 (TLIA) 和VEGI-192，这3种同工型在结构和功能上均具有一定的差异。可溶性的VEGI对结肠癌等恶性肿瘤表现出较好的反应率。体外实验表明，VEGI能显著抑制牛动脉内皮细胞与人脐静脉内皮细胞的增殖。此外，VEGI还能抑制内皮细胞形成血管状结构。体内实验研究显示，VEGI蛋白的胞外区(23～174位氨基酸)显著抑制同系移植的大肠癌MC-38的生长，且肿瘤血管化程度显著降低；同样，在浆细胞瘤异体肿瘤移植模型中，以上VEGI胞外区可有效抑制异体移植的肿瘤生长[3]。

VEGI-192是最晚被发现的VEGI亚型，能强力地抑制新生血管生成，显著抑制肿瘤生长，并且对肝肾几乎无毒性[4]。Wu等[5]研究发现无论在体或者体外，VEGI-192都能够有效的抑制MDA-MB-435乳腺癌细胞的增殖。在本研究中，我们试图通过973肺腺癌裸鼠移植瘤模型，评估rhVEGI-192对放射线有无增敏效应，并初步研究其作用机制。

1 材料和方法

1.1 动物及细胞株

雄性裸鼠，4～5周龄，体重20g左右，购自厦门大学实验动物中心。研究获得厦门大学医学院医学伦理委员会同意，动物饲养及给药处理严格遵守国家动物饲养和使用安全规范。rhVEGI-192菌株由李鲁远教授惠赠，蛋白由实验室自主提取。细胞株为973细胞株，厦门大学抗癌研究中心惠赠。

1.2 rhVEGI-192的制备

将融化后的细菌轻轻吹吸混匀，向每个离心管中加入50ul 细菌和500ul高压无菌的LB(LuriaBertani broth)培养基中，混匀后置于37℃,50rpm培养1h，使细菌复苏。将已复苏的细菌轻轻吹吸混匀，吸取200ul转接到200ml含有氨苄西林(50ug/ml)的LB培养基，混匀后置于28℃,200rpm，培养过夜。从摇床中取出锥形瓶，向LB培养基中加入诱导剂(isopropylthio-galactoside)，混匀后置于37℃, 20 000rpm，培养2h。 破碎菌体，溶解包涵体。用10倍沉淀重量的的洗涤缓冲液 (PH 8.0)重悬，8 800rpm，4℃，离心20min，弃上清，可重复此过程6～8次。用8M 尿素的裂解液(PH 8.0)溶解包涵体。离心，保留上清，将包涵体溶液和镍柱(Ni-Agarose)混合，然后用洗涤缓冲液洗涤杂蛋白。最后用洗脱缓冲液先进行洗脱并收集目的蛋白。将装有目的蛋白溶液的生物透析袋放入4M 尿素溶液中透析6h。将装有目的蛋白溶液的生物透析袋放入2M 尿素溶液中透析4h。将装有目的蛋白溶液的生物透析袋放入1M 尿素溶液中透析6h。将装有目的蛋白溶液的生物透析袋放入0M 尿素溶液中透析3h。rhVEGI-192的浓缩与过滤后使用。

1.3 实验分组及给药方法

随机将32只小鼠分成4个实验组，每组8只:空白组;rhVEGI-192组;10Gy组;rhVEGI-192+10Gy组。将呈指数增长的973细胞消化后制成浓度为3×106/mL个细胞的悬液。每只鼠右下肢大腿皮下注入0.1mL细胞悬液，隔日观察，待移植瘤长足够大小入组。根据实验分组和裸鼠体重计算给药剂量，采用腹腔注射给药方法，rhVEGI-192给药方式为5mg/kg.d，用生理盐水稀释。根据实验分组方法和每只裸鼠体重计算给药剂量，然后腹腔注射已经稀释好的药液，对照组注射同等体积的生理盐水。当肿瘤直径增长至0.5cm时开始用药，每天1次，连续14天。

1.4 放射方法

采用Varian 600直线加速器6MV-X线放射。将荷瘤裸鼠装入一自制的有机玻璃盒内，并将其用橡皮圈固定在一塑料板上，肿瘤暴露在正中，裸鼠其他部分采用铅块遮挡，肿瘤表面放置1.5cm有机玻璃板，在直线加速器下进行放射。肿瘤直径长至0.5cm时分组，于给药第7天放射，放射剂量为10Gy。

1.5 Western blot 检测细胞VEGF的表达

接种移植瘤的裸鼠在用药第28天，分别取各组的移植瘤标本。放在装有裂解液的研钵中研碎，然后冰上放置半小时。高速离心30min，去掉沉淀，取上清，测定蛋白浓度。电泳，转膜，5%的脱脂奶粉封闭，TBST洗3次，每次5分钟。加VEGF抗体，4℃孵育过夜，TBST洗3次，每次5分钟。加入2抗，室温孵育半小时，TBST洗3次，每次5分钟。加入AB显影液，压片，曝光。通过测定β-actin浓度，来调节样品上样量。

1.6 统计方法

统计方法应用SPSS11.5软件计算，采用Mann-whitney μ检验。P<0.05差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 荷瘤鼠的一般情况

在整个实验过程中空白对照组裸鼠进食、活动未见异常，5～6只裸鼠右下肢肿瘤局部皮肤可见溃烂；而单独照射和联合治疗组裸鼠活动及进食未受影响，2～3只裸鼠右下肢肿瘤皮肤溃烂现象。

2.2 目的蛋白的表达

本实验采用原核表达rhVEGI-192，用包涵体经Ni-Agarose亲和层析纯化，SDS-PAGE凝胶电泳扫描鉴定包涵体(图1)。目的蛋白位于22kD左右(箭头所指)的位置，与预期结果相符。使用蛋白凝胶Glyko BandScan分析得到目的蛋白的纯度在78%以上。可以明确所纯化的蛋白为目的蛋白。

图1 VEGI-192纯化蛋白凝胶电泳图

2.3 重组人血管内皮生长抑制因子对肺腺癌移植瘤的放射增敏系数

如表所示，rhVEGI-192+10Gy组的放射增敏系数为1.5，证实rhVEGI-192有明显的放射增敏作用(见表1)。

表1 重组人血管内皮生长抑制因子对肺腺癌移植瘤的放射增敏作用

倍增时间(Td)：移植瘤体积增至2倍所要的时间；绝对生长延迟时间(TAGD)：X线照射组的移植瘤体积与空白对照组的移植瘤体积均增至2倍所需的时间之差；标准化生长延迟时间(TNGD)：X线照射组+用药组移植瘤体积与单纯用药组移植瘤体积均增至2倍所需的时间之差；放射的增敏系数(EF)：为TNGD与TAGD的比值，当SER的比值>1时，说明有放射增敏作用。

2.4 重组人血管内皮生长抑制因子的移植瘤生长曲线

rhVEGI-192组移植瘤的生长较空白对照组受到抑制(P=0.000)，10Gy照射组生长较空白对照组受到抑制(P=0.000)，rhVEGI-192+10Gy组移植瘤生长较空白组生长显著抑制(P=0.000)，rhVEGI-192+10Gy组移植瘤较10Gy组有明显生长抑制(P=0.000)。根据各组裸鼠肿瘤体积，绘制移植瘤生长曲线(见图2)。

图2 第7天照射10Gy各组肿瘤的生长曲线1,空白组；2,10Gy组；3,VEGI组；4,VGEI-192+10Gy组

图3 VEGF表达分析

2.5 Western blotting检测VEGF蛋白的表达

通过 Western blotting 检测VEGF 的表达，以β-actin作为参照,如图3所示, 在actin相对等量的情况下, 和空白组相比, 10Gy组表达变化不明显，rhVEGI-192表达减少，rhVEGI-192+10Gy组和空白相比，表达更少(见图3)。

3 讨 论

自从Folkman教授发现肿瘤生长对血管的依赖现象后，关于血管靶向治疗增敏的研究一直不断被开发，并在近几年出现了井喷式的现象，不断有血管靶向药物被开发出来，其中代表性的药物有贝伐单抗，NRP-1mAb，VEGI[6-8]也是其中之一。Zhang等[9-11]研究发现VEGI能够通过激活JNK-GATA3信号通路，上调miR-29b抑制VEGF基因表达。 Qi等[12]研究发现TL1A能通过抑制内皮前体细胞而抑制血管生成。这些研究均发现VEGI对血管内皮的抑制作用。

本实验研究发现, VEGI联合放疗组较单照组肿瘤有轻度生长抑制，证实了联合VEGI的放射增敏效果。进一步计算VEGI-192+10Gy组的放射增敏系数为1.5，放射增敏系数大于1，进一步证实VEGI-192和放疗联合对肺973移植瘤具有明显的放射增敏作用，起到了增敏的效果。

Western blotting 检测第28天肿瘤标本VEGF 的表达，治疗组VEGF普遍下降，rhVEGI-192联合照射组合rhVEGI-192单药组相比，VEGF表达减少。说明联合应用进一步抑制了肿瘤细胞的VEGF的表达，起到了协同的作用。通过抑制VEGF，使肿瘤的生长抑制更加明显。

目前恶性肿瘤放射增敏的机制主要有4种：增加肿瘤细胞凋亡，降低肿瘤细胞DNA修复效能，调控细胞周期检测，改善肿瘤细胞乏氧。有文献证实[13]，放疗能诱导肿瘤细胞VEGF表达。这种高表达提示肿瘤内部处于乏氧状态，肿瘤对放疗不敏感，而高表达的VEGF保护了血管内皮细胞免于放射致死性杀伤。为肿瘤进一步生长提供了可能。

VEGI能够通过一系列通路调节VEGF水平。首先，TNFSF15同时下调mFlt1和上调 sFlt1在血管内皮祖细胞中的水平,从而调节VEGF和PlGF的表达。其次，VEGI能够激活P38和JNK 从而使增殖的血管内皮细胞凋亡。另外，VEGI还能使G0/G1期的血管内皮细胞停滞在早G1期。同时，VEGI能够抑制血管内皮祖细胞分化[14]。达到抑制新生血管形成和重塑已有的血管[15]。从而使肿瘤细胞的生长受到抑制。并且改善了肿瘤细胞内部的杂乱的血管情况。

Tian等[14]研究开发了rhVEGI-192，显示rhVEGI-192能够引起内皮细胞的凋亡，抑制内皮细胞的增值，从而抑制新生血管生成。本实验研究证实了rhVEGI-192的通过抑制VEGF发挥放疗增敏的作用。目前关于VEGI，有进一步研究发现它能够通过增强免疫力抑制肿瘤生长[16]，并且血清中VEGI的水平对肿瘤的预后相关[17]，具体机制有待进一步研究。

作者声明：本文第一作者对于研究和撰写的论文出现的不端行为承担相应责任；

利益冲突：本文全部作者均认同文章无相关利益冲突；

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[参考文献]

[1] Ma WH, Shao YH, Yang WD, et al. Evaluation of 188Re-labeled NGR-VEGI protein for radioimaging and radiotherapy in mice bearing human fibrosarcoma HT-1080 xenografts[J]. Tumor Biol, 2016, 37(7):9121-9129.

[2] Maninder SV, David QS, Stephan RT, et al. Differential levels of Tl1a affect the expansion and function of regulatory T cells in modulating murine colitis [J]. Inflamm Bowel Dis, 2016, 22(3): 548-559.

[3] Tomasz JS, Tania FR, John RF, et al. Triggering of TNFRSF25 promotes CD81 T-cell responses and anti-tumor immunity[J]. Eur J Immunol, 2011, 41(9): 2606-2611.

[4] Itay L, Marianna Z, Amir A, et al. Directed evolution of a soluble human DR3 receptor for the inhibition of TL1A induced cytokine secretion[J]. Plos One, 2017, 12(3): e0173460.

[5] Wu J, Jiang Y, Yang W, et al. Dual function of RGD-modified VEGI-192 for breast cancer treatment[J]. Bioconjug Chem, 2012, 23(4):796-804.

[6] Marisi G, Scarpi E, Passardi A, et al. Circulating VEGF and eNOS variations as predictors of outcome in metastatic colorectal cancer patients receiving bevacizumab[J]. Sci Rep, 2017,27(1):1293.

[7] 张姣，高春玲. 血管内皮生长因子抑制剂及在放疗中的作用的相关研究进展[J]. 肿瘤预防与治疗, 2014, 27(1):52-56.

[8] 谈文娟，高春玲. NRP-1在肿瘤中的作用及机制研究进展[J]. 肿瘤预防与治疗, 2015,28(6) :356-360.

[9] Zhang K, Cai HX, Gao S, et al. TNFSF15 suppresses VEGF production in endothelial cells by stimulating miR-29b expression via activation of JNK-GATA3 signals[J]. Oncotarget, 2016, 7(43): 69436-69449.

[10] Zhang Z ，Li LY.TNFSF15 Modulates Neovascularization and Inflammation[J]. Cancer Microenviron, 2012,5(3):237-247.

[11] Liang PH, Tian F, Lu Y, et al.Vascular endothelial growth inhibitor (VEGI; TNFSF15) inhibits bone marrow-derived endothelial progenitor cell incorporation into Lewis lung carcinoma tumors[J]. Angiogenesis, 2011,14(1): 61-68.

[12] Qi JW, Qin TT, Xu LX,et al. TNFSF15 inhibits vasculogenesis by regulating relative levels of membrane-bound and soluble isoforms of VEGF receptor 1[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2013,110(34):13863-13868.

[13] Gorski DH, Beckett MA, Jaskowiak NT, et al. Blockade of the vascular endothelial growth factor stress response increases the antitumor effects of ionizing radiation[J]. Cancer Res, 1999, 59:3374-3378.

[14] Tian F, Paulina H, Li LY, et al. Inhibition of endothelial progenitor cell differentiation by VEGI[J]. Blood, 2009,113(21):5352-5360.

[15] Christian P, Chun HG, Gareth W, et al. Reduced vascular endothelial growth inhibitor(VEGI) expression is associated with poor prognosis in breast cancer patients[J]. Angiogenesis, 2006, 9(2):73-81.

[16] Han S, Liu L, Xu FY, et al. A case-control study about the association between vascular endothelial growth inhibitor gene polymorphisms and breast cancer risk in female patients in Northeast China[J]. Chin J Cancer Res, 2016, 28(4):435-443.

[17] Wang J, Andrew J. Sande G，et al. Vascular endothelial growth inhibitor (VEGI) is an independent indicator for invasion in human pituitary adenomas[J]. Anticancer Res, 2013,33(9):3815-3822.