基于半仿生及体外抗肿瘤细胞株实验技术对土鳖虫最佳用酶的筛选

毛会秀，桑 晓，管西芹，张 瑞，王彦多，李 丽，曹广超，刘金虎，蔡梅超

(山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355)

1 仪器与材料

1.1 仪器

KDN-2C定氮仪配四孔消化炉(上海纤检仪器有限公司)； MSM-2008型超滤器(上海摩速科学器材)；MemmentCO2培养箱(北京五洲东方科技发展有限公司)等。

1.2 试剂

土鳖虫粉(山东中医药大学实验室自制，批号20150501)，经山东中医药大学高德民副教授鉴定为鳖蠊科昆虫地鳖(EupoLyphaga sinensis WaLker)；胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶(上海源叶生物科技有限公司)；改良型RPMI-1640培养基、胎牛血清(赛默飞世尔生物制品北京有限公司)；所有试剂为分析纯。

1.3 实验细胞

喉癌细胞(Hep-2)、肝癌细胞(Bel-7402)等细胞株由山东省立医院提供。

2 方法

2.1 土鳖虫酶解工艺最佳用酶的初步筛选

精密称取中药土鳖虫粉五份，每份1.0000 g，按料液比1∶40加入蒸馏水，超声提取30 min，按表1进行处理，因正常情况下，胃液pH值为1.3～1.8，最高pH值可达到3.5，选择胃蛋白酶的适宜pH值为2.0，胰蛋白酶的pH值为7.8～8.4，选择胰蛋白酶的适宜pH值为8.0。酶解完全后在3000 r/min离心10 min，抽滤，定容至100 mL容量瓶中，得土鳖虫酶解液。并将每种酶解液一部分用于测蛋白质的水解度，另一部分制备冻干粉。

表1 四种蛋白酶的水解条件Table 1 Hydrolysis conditions of four kinds of protease

2.2 氨基肽氮的含量测定

2.2.1 茚三酮显色剂的配制

精密称取茚三酮0.5 g，果糖0.3 g，磷酸氢二钠10 g，磷酸二氢钾6 g，定容至100 mL。

2.2.2 标准曲线的绘制

精密称取干燥过甘氨酸0.1000 g，溶解完全后，定容到100 mL的容量瓶中，取2.0 mL定容至100 mL得20 μg/mL的溶液，然后分别取1，2，3，4，5 mL定容至10 mL，配成2，4，6，8，10 μg/mL的标准溶液，再分别取2 mL稀释液于试管中，同时做空白试验，加入1.00 mL显色剂，摇匀后放入沸水浴中加热15 min，冷水冷却至与乙醇温度相同，加入40%乙醇溶液5.00 mL摇匀，放置15 min,在570 nm下测定吸光度A，绘制标准曲线。

2.2.3 样品含量的测定

分别取土鳖虫酶解液和土鳖虫水提液，定量的稀释到一定浓度，按照“2.2.2”方法测定酶解液和水提液的吸光度A，利用标准曲线计算出水解液中总氨基态氮的含量。

水解度(Degree of Hydrolysis，简称DH)%=已水解的肽键数/原料中总肽键数×100%=(B-C)/(A-C)×100%

式中：A：原料中的总氮数；B：水解液中的氨基氮数；C：原料中游离的氨基氮数。

2.3 MTT法测定土鳖虫冻干粉对三个细胞株的抑制率

将处于对数生长期的细胞以每孔100 μL接种于96孔板中，在5%CO2、37℃培养箱中培养。24 h后，弃去培养基，空白组加入100 μL不含血清的1640培养基，阳性对照组加入100 μL 100 μg/mL的顺铂，其他孔分别加入100 μL不同浓度的药物，每个浓度的药物重复5个孔，将细胞放在培养箱中继续培养。24 h后，在避光的条件下每孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，继续培养，4 h后，吸掉上清液，加入100 μL DMSO溶液，设置六个调零孔，然后在492 nm酶标仪下测定OD值，计算细胞抑制率。

细胞抑制率(%)=[1-(加药组OD-调零组OD)/(空白组OD-调零组OD)]×100 %。

3 结果

3.1 氨基态氮的含量测定

3.1.1 标准曲线的绘制

茚三酮法在570 nm下测定蛋白质中游离-NH2的吸光度，然后以甘氨酸的浓度(μg/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线,得到回归方程为y=0.0412x-0.0008，R=0.9993。

3.1.2 样品中氨基肽氮的含量测定

由表2可知，弹性蛋白酶酶解液中-NH2含量最高，依次是胰蛋白酶酶解液、胃蛋白酶酶解液，胰凝乳蛋白酶酶解液-NH2含量最少。

表2 土鳖虫水解液中氨基态氮的含量Table 2 Contents of amino nitrogen in Eupolyphaga sinensis Hydrolysates

3.2 样品中蛋白质水解度的测定

用半微量凯氏定氮法测定1.0000 g土鳖虫粉总氮量为85.2437 mg，依据水解度的计算公式求解出四种不同蛋白酶的水解度，如图1。

图1 四种蛋白酶的水解度
Fig.1 The degree of hydrolysis of four proteases

由图1可得，弹性蛋白酶的水解能力最高，水解度达到9.95%，依次从大到小的顺序为胰蛋白酶、胃蛋白酶，水解度为6.76%、4.94%，最小的水解度是胰凝乳蛋白酶，达到2.29%。

3.3 MTT法测定土鳖虫酶解产物对不同肿瘤细胞的抑制率

3.3.1 不同浓度的土鳖虫酶解液对肝癌Bel-7402细胞株的抑制效果

见图2。

图2 水解液对Bel-7402的抑制率
Fig.2 Hydrolysis of Bel-7402 inhibition rate

由图2可知，胰蛋白酶水解液和弹性蛋白酶水解液对肝癌细胞的抑制曲线是直线上升的，当胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶三者水解液浓度最大时，抑制效果最好；而胃蛋白酶水解液对肝癌细胞抑制效果并不明显，有的浓度甚至出现了负增长的现象，所以得出胃蛋白酶水提液对肝癌细胞无作用效果。在最大浓度时，纯水提液对Bel-7402的抑制率很大，是对肝癌细胞有抑制作用的成分累积，使得在最大浓度比低浓度的抑制效果明显。所以得出四种蛋白酶水解液在高浓度时对肝癌细胞抑制效果明显的是胰蛋白酶水解液、弹性蛋白酶水解液和胰凝乳蛋白酶水解液。

3.3.2 不同浓度的土鳖虫酶解液对喉癌Hep-2细胞株的抑制效果

见图3。

图3 水解液对Hep-2的抑制率
Fig.3 Hydrolyzate inhibition rate of Hep-2

由图3可得，胰蛋白酶水解液和弹性蛋白酶水解液对喉癌细胞的抑制率随浓度的升高而逐渐升高，且在最大浓度时，抑制效果达到最好；胰凝乳蛋白酶水解液、胃蛋白酶水解液和纯水提液的抑制率均低于零，对喉癌细胞有负增长现象，因此三者水提液对喉癌细胞的药理作用无效。由此得出对喉癌细胞抑制效果最佳的蛋白酶是：胰蛋白酶和弹性蛋白酶。

4 讨论

通过本实验结果显示，酶解土鳖虫得到水解度最高的是弹性蛋白酶，其他依次为胰蛋白酶、胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，而采用MTT法的药理实验结果显示，蛋白酶水解液对不同肿瘤细胞的抑制效果不同，对于肝癌细胞，在最高浓度时，胰蛋白酶、弹性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶三者水提液的抑制作用最为明显；对于喉癌细胞，胰蛋白酶水解液和弹性蛋白酶水解液的抑制效果最好，且随浓度的升高而升高，在最高浓度时抑制率达到最大值。本实验的水解度和MTT法药理实验结果也有一定关联性，如胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的水解度都较低，对喉癌细胞的抑制效果不明显；不同酶解液对不同肿瘤细胞的抑制效果不同，进而本实验筛选出土鳖虫对肝癌细胞的最佳用酶为胰蛋白酶，依次为弹性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，对喉癌细胞的最佳用酶是胰蛋白酶和弹性蛋白酶，进而为下一步土鳖虫最佳用酶的工艺打下了基础。

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(本文文献格式：毛会秀，桑晓，管西芹，等.基于半仿生及体外抗肿瘤细胞株实验技术对土鳖虫最佳用酶的筛选[J].山东化工,2018,47(7):10-12.)