食源性致病菌RPA检测技术研究进展

胡金强,魏向珂,黄润娜,孙新城,2,景建洲,2,高 辉,2,耿 尧,2,董彩文,姜春鹏

(1.郑州轻工业学院,食品与生物工程学院,河南郑州 450000;2.河南省食品安全国际联合实验室,河南郑州 450000;3.食品生产与安全河南省协同创新中心,河南郑州 450000)

“民以食为天,食以安为先”[1]。食源性致病菌在全世界广泛分布,每年导致成千上万例人类疾病,是世界头号食品安全问题。据世界卫生组织报道,全球每年有多达6亿人因食用受到污染的食品而患病,其中有42万人因食源性疾病死亡[2]。在众多食源性致病菌中,尤以大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌等影响范围广泛[3],对人类身心健康产生极大危害,且造成重大经济损失,最终导致严重的公共卫生安全问题。由此可见,开发食源性致病菌快速检测技术,防控食源性疾病的发生与发展,在食品安全与公共卫生方面具有重大意义。

利用传统检测方法如聚合酶链式反应(PCR)、多重PCR、酶联免疫吸附技术(ELISA)等检测食源性致病菌仍存在耗时、操作繁琐、检测结果不准确等问题[4]。尤其是灵敏度、特异性以及实用性低等技术问题,已经严重制约了这些技术的推广应用。因此,迫切需要更加灵敏、高效、快速、敏感、特异方法应用于食源性致病的检测[5],以实现对食源性致病菌的有效监控。在这种背景下,重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification,RPA)满足了食源性致病菌检测的技术需求,近年来得到了快速发展。本文将对RPA及其衍生技术作简要介绍。

1 RPA技术原理与技术简介

RPA技术是一种新型的恒温扩增技术,反应模式与PCR相似,不同的是RPA不需要原始的加热步骤使DNA模板变性,而是利用重组酶引物复合物扫描双链DNA,进而促进DNA链上同源位点的互换[6]。RPA反应所需要的关键酶是能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、DNA单链结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶[7]。RPA技术原理如图1所示[8]:a. 重组酶与长约30～35 nt的引物结合形成的复合物在双链DNA模板中寻找靶位点;b. 复合物在模板上定位后可以直接引发链交换反应形成D状环,SSB随即结合被置换的DNA链,形成D-Loop结构,防止引物解离;c. 重组酶-引物复合物主动水解体系中的ATP导致复合物构象改变,重组酶解离后引物3′端暴露并被链置换DNA聚合酶识别,DNA聚合酶按照模板序列在引物3′末端添加相应碱基,DNA扩增反应启动;d. 链置换DNA聚合酶在延伸引物的同时继续解开模板的双螺旋DNA结构,DNA合成过程继续进行;e. 两条引物扩增完成即形成一个完整的扩增子[8]。RPA反应不需要精确的温度控制,所有反应步骤可在37～42 ℃完成,并且在20 min内即可达到检测水平[9-10]。除此之外,RPA可实现对不纯样品的检测,反应试剂可以冻干形式保存使用,不需要再以冷链形式储存运输[11]。

图1 RPA技术原理示意图Fig.1 Schematic of RPA principle

2 RPA及其各个衍生技术的应用

RPA作为等温扩增技术中的后起之秀[12],结合了血清学和分子技术的优点,并克服了两种方法的缺点,是一种简单、快速、性价比高的诊断工具,能够实现实验室外的现场精确检测[13]。并且在RPA基础上实现了其衍生技术的应用与发展,使RPA的应用范围更加广泛,技术更加创新、实用。

2.1 直接重组酶聚合酶扩增技术(Direct-RPA)

Direct-RPA[14]和直接聚合酶链式反应(Direct-PCR)一样[15],在不进行复杂样品前处理步骤的情况下,在常温下就可以进行样品中目标基因扩增,大大简化了整个过程分析。

Choi等[16]利用离心Direct-RPA,对被污染牛奶样品进行检测,以3.2 μL含有4×104个目标细菌的牛奶作为待检样品,以没有被污染牛奶作为阴性对照。在检测前用荧光基团标记目的基因。结果表明,与阴性对照相比,含菌牛奶样品的荧光信号在反应中明显增强,对照组则无变化。另外对细菌灵敏度也进行了检测,培养细菌进行连续稀释10倍,在3.2 μL牛奶中细菌细胞个数从4×104～4×100,之后进行检测得出在3.2 μL牛奶中细菌细胞个数最低检出限为4个细胞。此方法在30 min内可检出牛奶中的沙门氏菌、大肠杆菌O157∶H7、副溶血性弧菌。并且,此实验无需DNA提取步骤可直接从牛奶样品中检测目标食源性致病菌。

离心Direct-RPA具有很大优势,包括无需样品预处理步骤,反应时间短、重复性好。这些优势赋予了离心Direct-RPA微装置良好的现场诊断效果,可对食源性致病菌进行快速、高灵敏度、高准确度安全性检测。然而,Direct-RPA的缺点在于需要离心机和荧光显微镜,在一定程度上失去了现场诊断价值。

2.2 重组酶聚合酶扩增侧流层析技术(RPA-LFD)

侧流层析试纸条(LFD)目前用于定性、半定量检测的简单装置,用于资源贫乏或非实验室环境[17]。RPA和LFD相结合可建立一种灵敏、特异、快速与直观的现场跟踪目标物的检测系统。

RPA-LFD基于RPA扩增原理,利用带生物素标记引物和带羧基荧光素(FAM)标记的探针与靶核酸进行扩增反应,最终扩增产物携带FAM和生物素标记[18]。LFD前端包被带FAM抗体的纳米金粒,检测线(T)上包被生物素抗体,当反应液进入试纸条时,带有FAM和生物素的扩增产物通过抗原抗体结合作用,在检测线上形成“生物素抗体-核酸-纳米金粒”复合物显色。质控线上包被抗FAM抗体的固定抗体,可直接与带FAM抗体的纳米金粒结合,在质控线上显色,以确保试纸条的有效性[19-20]。RPA-LFD检测可在15～20 min内完成,在25～45 ℃的环境中均可进行检测,最适温度为35～45 ℃。因此,可用一些简单的加热装备,比如电热水器甚至体温便可实现精确检测[9-10]。RPA-LFD检测结果在横向流动试纸条上显示红色条带,裸眼就可观察,即使是非专业人员也可以直接观察分析结果,非常适用于实地检测,特别在经济条件差,资源不足区域更具良好的应用前景[21]。

Kim等[22]运用此方法检测PBS缓冲液和牛奶中的沙门氏菌,RPA反应和LFD二者用一个固体装置连接起来,在此固体装置上装有一个单一的激光二极管用于无线控制阀门驱动,此二极管用于细菌细胞热裂解及等温扩增步骤时进行的非接触加热,裂解后的细菌DNA溶液和RPA预混液在扩增室混合进行反应,最后样品溶液被吸入到LFD试纸条上,5 min后裸眼观察检测结果。整个实验过程在30 min内即可完成。此外,为了获得高的检测灵敏度,混有不同稀释梯度沙门氏菌溶液的1 mL PBS缓冲液和1 mL牛奶在用抗体包裹的磁珠载入椎间盘之前被浓缩。实验结果得出PBS缓冲液和牛奶中的沙门氏菌检出限分别为10 CFU/mL和100 CFU/mL。Liu等[23]用RPA-LFD检测牛奶和鸡胸肉中的沙门氏菌,并且在灵敏度、特异性等方面进行了研究,优化了反应温度和反应时间,和PCR-LFD进行了对比,结果显示RPA-LFD的检出限为1.05×101CFU/mL,而PCR-LFD的检出限为1.05×105CFU/mL,结果表明RPA-LFD的检出限比较低,灵敏度高。

RPA-LFD的缺点在于,RPA反应产物需要进行适度稀释,如果稀释不够,容易造成假阳性结果,而且开放环境操作RPA-LFD同样会造成该方法的假阳性结果;此外,RPA-LFD最多可进行二重食源性致病菌检测,限制了检测的效率。

2.3 重组酶聚合酶扩增酶联免疫吸附技术(RPA-ELISA)

RPA-ELISA,即RPA与ELISA相结合技术。该方法进行DNA扩增可在40 ℃下、40 min左右完成反应。对于标记产品进行杂交,用特异性5′-生物素与链霉亲和素标记的探针在包被微孔板上进行反应,在室温下即可进行,结果可用比色法进行检测[24-25]。

Santiago-Felipe等[24]利用RPA-ELISA技术同时检测了榛子、花生、大豆、番茄和玉米中的过敏原、转基因启动子-P35S、转基因终止子-TNOS、病原菌沙门氏菌和阪崎肠杆菌以及霉菌。结果表明,每个分析物的检出限为1.3～5.3 μg/g,病原菌菌体浓度为6～13 CFU/mL,不仅比PCR-ELISA的灵敏度与重复性高,而且RPA-ELISA技术更适合应用于边远地区、山区等资源缺乏环境。

除了RPA-ELISA技术,类似的等温扩增技术和ELISA技术结合使用的还有环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)[26]和解旋酶依赖性扩增(Helicase-dependent amplification,HDA)[27]。上述技术具有很多技术优点:如不需要昂贵的实验设备,可在几个小时内处理几百个样品,非常灵活方便。但是与RPA-ELISA相比,这两种技术所需温度或者引物条件较苛刻。比如,RPA-ELISA反应温度在37～42 ℃即可,避免了热循环,也不需复杂的引物设计;HDA-RPA则需要在95 ℃条件下进行变性,LAMP-ELISA需要复杂的引物设计才能完成接下来步骤[28]。除此之外,RPA-ELISA也是一种快速、低成本的半定量分析技术,在选择性、灵敏度、重现性以及高通量等方面表现出优异的分析性能。再者,在DNA提取步骤之后,检测过程可在2 h内进行完毕,所有样品在只有一个扩增条件和相同检测技术下可同时处理。

RPA-ELISA技术也存在一些缺陷,比如重复性不好,易出现假阳性,温度和时间等实验参数对实验结果影响很大。

2.4 实时重组酶聚合酶扩增技术(Real-time RPA)

Real-time RPA,即实时荧光定量RPA,与Real-time PCR比较,Real-time RPA检测结果与前者具有相同的灵敏度与特异性[29],然而Real-time RPA的检测过程所需时间明显短于Real-time PCR,即Real-time RPA所需时间是7～15 min,Real-time PCR则需耗时90 min[30],且与Real-time RPA相比,Real-time PCR的实验操作设备较复杂、昂贵,而且所占空间大、不便携带。除此之外,Real-time PCR需要一个热循环过程且实验操作步骤复杂[31],而Real-time RPA实验操作温度在37～42 ℃的条件下便可进行,无需复杂的操作程序。

RPA扩增结果可通过实时荧光定量检测[32]。RPA扩增的实时检测依赖于核酸外切酶Ⅲ,它会切断exo-探针中的四氢呋喃(THF),导致荧光基团和荧光淬灭基团的分离[33-35],扩增结果通过exo-探针检测。此探针携带一个荧光基团和一个荧光淬灭基团,分别与一个胸腺嘧啶结合,中间由一个四氢呋喃(THF)碱基隔开,当此结构完整时,荧光强度低[36]。当探针与靶序列结合时,连接荧光基团和淬灭基团的THF碱基位点就会被核酸外切酶Ⅲ识别并酶解,下游的淬灭基团被释放,荧光强度增强。酶切后产生的游离3′-OH作为DNA聚合酶的靶点并扩增此探针,荧光强度也会随着其扩增而增强[37]。荧光强度信号实时检测由荧光信号检测器[38]或扫描仪[39]完成,其敏感度强、特异性强,检测所需时间短。Kim等[40]用此方法对鸡蛋、鸡肉和鸡汤中的结肠弯曲杆菌和空肠弯曲杆菌进行了双重检测,实验在45 ℃温度条件下进行20 min即可完成,结果显示在纯培养物中结肠弯曲杆菌和空肠弯曲杆菌的检出限是1 CFU/反应,在鸡汤中的检出限是1 CFU/mL,在没有预富集的情况下鸡蛋和鸡肉中的检出限是103CFU/g,经过24 h富集培养后鸡蛋和鸡肉中结肠弯曲杆菌和空肠弯曲杆菌的检出限是1 CFU/g。并且和另外33种细菌进行了特异性检测,结果表明只有空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌是阳性,其余均为阴性。Clancy等[41]使用编码前导肽酶作为分子诊断靶基因,利用Real-time RPA检测全血中肺炎链球菌,并进行相应的实验和优化,并且在灵敏度和检出限方面和Real-time PCR进行对比。结果显示两者的灵敏度相当,均为100%,Real-time RPA的检出限是4.0个基因组/反应,而Real-time PCR的检出限是5.1个基因组/反应,二者检出限也相差不是太多,但是就反应动力学而言,Real-time RPA要比Real-time PCR快得多,仅需20 min即可完成反应,而后者需要数小时。除此之外,Real-time RPA也成功实现了对弗朗西斯土拉热杆菌[34]、B族链球菌[42]、布鲁氏杆菌[43]以及产志贺毒素大肠杆菌[44]等的检测(表1)。

表1 RPA技术在食源性致病菌检测领域的应用Table 1 Application of RPA technology for the detection of foodborne pathogenic bacteria

Real-time RPA本身也具有一些缺点,例如实验成本高,需要荧光定量设备,而且该技术容易造成交叉污染,导致假阳性结果出现。

2.5 RPA微流体

微流体是一种将样品准备、核酸扩增及产物检测结合于一体的集成设备,省略了准备、配制试剂的过程,已广泛应用于分子诊断领域[37]。Hakenberg等[45]首次在微流体系统上成功实现反应试剂的被动层流混合,此系统实现了芯片微体积的试剂溶解混合,此方法促进了RPA研究朝高通量的方向发展。

Lutz等[46-47]将RPA反应与微流体芯片反应装置系统相结合,实现实时检测。该微流体包括液体反应剂的玻璃安瓿和冻干试剂。液体反应液包括缓冲液及镁离子等,冻干试剂包括各种酶、引物及探针等。该系统在装有孵育器的箔片离心装置上设计了几个小型反应腔室。当需要检测时缓冲液和冻干试剂在不同的反应腔室中通过离心使两者混合。这种自动系统可以在20 min内实现多个反应同时进行的极高灵敏度检测,在实验中检测到了少于10个拷贝数的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)。Kersting等[48]把微阵列技术与多重扩增RPA相结合,在四个反应室内可同时扩增四个反应靶标,扩增子通过与荧光基团偶联的反向寡核苷酸引物进行标记。扩增和空间分辨信号的产生依赖于环氧-硅烷化的玻璃表面结合的固定化正向引物上,此过程在泵驱动杂交室中完成。在38 ℃下,微阵列技术和RPA技术的组合允许在相当小的区域内进行多参数分析,反应在20 min内完成,实验得出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌(Salmonellaenterica)的检出限是10 CFU/mL,淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)的检出限是100 CFU/mL,实现了同时检测淋病奈瑟氏菌、肠炎沙门氏菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

Tsaloglou等[49]利用微流体滑动芯片与RPA技术相结合,检测出了艰难梭状芽孢杆菌,芯片上RPA测定的靶向艰难梭菌毒素B基因(tcdB)编码毒素B,编码出的其中一种蛋白质负责细菌毒性。该装置用透明丙烯酸制造,采用快速成型方法。它有六个重复的500 nL反应孔以及两组500 nL对照孔,反应在此装置上进行,用荧光探针进行实时监测。该反应在20 min内完成,实验结果得出艰难梭状芽孢杆菌的检出限为1 fg。Eid等[50]在微流体芯片上等速电泳(ITP)与RPA技术相结合检测全血中的单增李斯特菌,在微流体芯片上用ITP进行纯化处理25 μL样品量,将细菌DNA与全血污染物分离,之后将提取的DNA直接转移到RPA预混液中进行等温孵育和检测。纯化提取DNA和检测所需总的时间在75 min内可以完成。实验结果检测出单增李斯特菌的检出限是5×103～2×104个细胞/mL。

RPA微流体虽然集成度较高,但是研发与使用成本较高,制作与组装程序复杂、周期长,推广使用具有一定难度。

3 总结与展望

食品是人类赖以生存的物质基础,食品安全是关系到社稷民生的重大问题,食源性致病菌作为食品安全问题的首要隐患,传统检测技术已不能满足食源性致病菌检测需求,因此建立快速、灵敏、特异、多重的检测方法十分必要。RPA技术作为一个新兴的分子检测技术,到目前为止,不仅在医学和药学方面应用较多,而且在食源性致病菌检测方面也开始崭露头角。RPA技术具有诸多技术优势:不需要热循环,在室温37～42 ℃左右即可完成反应;反应时间短,只需15～20 min;携带方便,RPA与LFD、ELISA、荧光等技术结合可实现实地检测和便携式携带等。然而,RPA技术也有一些缺点与不足,比如RPA涉及的酶类比较昂贵、检测对象单一、电泳检测需对产物进行纯化等。鉴于此,未来RPA将朝着经济、高通量、多重化以及更加快速、便携、敏感、特异的方向发展,相信在不远的将来RPA会在食品安全检测领域发挥重要作用。

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