贝酵母ADR1基因的克隆和生物信息学分析

张先昂,贺 笑,刘小珍,叶琴霞,黄彩双,文丽辉,张汉尧,*

(1.西南林业大学云南省高校林木遗传改良与繁育重点实验室,云南昆明 650224;2.安徽师范大学生命科学院,安徽芜湖 241000)

葡萄酒是酵母、细菌和其他真菌中复杂相互作用的产物,它们始于葡萄汁并且继续发酵直至最终成为葡萄酒[1-3]。发酵的酵母种类,主要是由葡萄表面所携带的酵母种类和葡萄酒加工过程中添加的酵母种类所决定的。酿酒酵母是公认的主要用于葡萄酒酿造的微生物[4]。然而,其他酵母属种(Saccharomycesnon-cerevisiae yeasts,SNC),也可以在葡萄酒的发酵中发挥重要的作用。葡萄酒酿造中贝酵母的使用频率低于酿酒酵母,但是在一些葡萄酒产区,葡萄酒需在较低的温度条件下发酵，贝酵母的生产效率比酿酒酵母高。例如:西班牙的巴斯克地区[5]、法国的阿尔萨斯[6]、苏玳的卢瓦尔河谷[7]、意大利的瓦尔波利塞拉[8]和乌克兰的雅尔塔[9]等地区生产的长相思白葡萄酒。在过去的几年中,由于目前的市场需求和气候变化对葡萄酒质量的影响,酿酒厂正面临着新的挑战,贝酵母将有助于解决这些挑战。它在低温下表现出良好的发酵能力,产出具有低级醇和更高甘油含量的葡萄酒[10-12]。

在葡萄酒生产过程中,乙醇是我们所需要的重要次生代谢物。但是当在发酵过程中乙醇的含量增加时,会影响细胞体外渗透压并且抑制细胞的生长和活性,会对酵母正常生存和代谢产生影响[13]。酿酒酵母的ADR1基因编码过氧化物酶蛋白,这种过氧化氢利用乙醇作为底物,氧化后使乙醇这种对酵母本身有毒性的物质变成无毒性的物质——乙醛,同时也使H2O2进一步变成无毒的H2O[14]。同时,发酵性糖积累过多时，不仅使乙醇积累过多对酵母产生毒害,而且会使酵母发生葡萄糖阻遏作用。这也会给其他有害菌生长创造条件,生成其他物质,降低出酒率和酒的品质。以往的研究表明,ADR1转录的mRNA和ADR1-b-galactosidase融合蛋白在葡萄糖抑制期间被发现,这种ADR1蛋白的活动被控制翻译后修饰水平去适当的ADH2的表达。ADR1-b-galactosidase融合蛋白可以在葡萄糖阻遏作用期间激活ADH2的表达并且显著提高ADH2基因的脱抑制能力。当ADR1在多拷贝质粒上表达时也获得相似的结果[15-21]。这就表明，ADR1基因在含糖量高的情况下可以破除葡萄糖阻遏的作用,并且提高酵母的乙醇代谢,从而消耗次生代谢物,使葡萄酒的酒精含量增加,使葡萄酒的风味更佳。

本研究对贝酵母ADR1基因进行了克隆,并利用在线分析工具ProtParam、ProtScale、TMHMM、PredictProtein、Swiss-Model等软件对其编码蛋白质的基本理化性质进行分析,同时预测了该基因所编码蛋白质的二级结构和三级结构,以分析贝酵母ADR1基因功能,为进一步利用贝酵母ADR1基因打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

贝酵母菌株BZL05 以产自香格里拉的葡萄皮上分离而出；酵母膏、蛋白胨、琼脂、葡萄糖、溶细胞酶 天根生化科技有限公司;上样缓冲液、核酸染料 百泰克公司;100 bp DNA Marker 博迈德公司;dNTPs Mixture、Taq polymerase 纽英伦生物技术(北京)有限公司;引物合成 均由上海生工公司完成。

DK98-1数显恒温水浴 天津泰斯特仪器有限公司；Centrifuge 5810R离心机 德国Eppendorf公司；PYX-DHG-9023-A干燥箱 上海新诺仪器设备有限公司；TP650 PCR仪 日本TaKaRa公司；Pico17小型离心机 美国Thermo公司；DYY-10C电泳仪 北京百晶生物技术有限公司；GBOXHR凝胶成像分析系统 美国Syngene公司；温控摇床 德国Sartorius；YXQ-LS-75SII灭菌锅 上海博讯实业有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台 苏州净化工程公司；移液枪 德国Eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 贝酵母基因组DNA的获取方式 为了保障所提取的DNA均为高品质,可选择试剂盒进行DNA提取实验操作。与此同时,可选用琼脂糖凝胶实施电泳检测。

1.2.2 贝酵母ADR1基因的获取方式 根据已公布的贝酵母基因组[22]数据,利用Primer Primer3,确定上游引物

ADR1L1:5′-TCTTCTTGGACTGCCGCTAT-3′

ADR1L2:5′-ATCGAATGGCAACGAGAATC-3′

ADR1L3:5′-ATCGAATGGCAACGAGAATC-3′

及下游引物

ADR1R1:5′-GAAAGGCCAATTTCGTTTGA-3′

ADR1R2:5′-TGCACATGTTCCTCAATGGT-3′

ADR1R3:5′-GTGCACATGTTCCTCAATGG-3′

进行PCR扩增。反应体系参考贺笑[23]关于贝酵母FZF1基因的方法。

聚合酶链式反应的程序为:在95 ℃的环境下预变性为5 min;同样95 ℃温度下变性时长为30 s;退火温度为58 ℃,时长为30 s;延长时间为60 s,温度保持在72 ℃,循环三十五次;之后在72 ℃温度节点延伸7 min;温度4 ℃保存样品。将聚合酶链式反应的产物保存在-20 ℃的冰箱中。

1.2.3 贝酵母ADR1基因的序列测定和所翻译蛋白的分析 聚合酶链式反应的产物通过琼脂凝胶的电泳测试之后,交由上海生工进行ADR1贝酵母测序。借助ORF Finder工具对该测序并拼接出的核苷酸序列中存有的开放阅读栏进行查找。同时利用在线检测工具分析这条核苷酸中翻译的蛋白质,如基本的理化性质(ProtParam)、亲水性(ProtScale)、跨膜区(TMHMM)、信号肽(SignalP)、激酶磷酸化修饰位点预测(KinasePhos)、Coil区分析(Coils Server)、亚细胞定位(TargetP和PSORT)和结构域(SMART)方面的分析。最后预测该蛋白的二级结构(PredictProtein)以及其三级结构(Swiss-Model)。

2 结果与分析

2.1 ADR1基因扩增结果和分析

ADR1基因经过聚合酶链式反应(PCR)扩增后,通过琼脂糖凝胶电泳分离。得到图1的凝胶图后,通过与Marker的比对得出其大小在3000～4500 bp之间,与后期测序所得结果相符。

图1 ADR1基因PCR检测结果Fig.1 PCR determination of ADR1 gene 注:1为ADR1基因PCR;2为DNA ladder。

2.2 贝酵母ADR1基因编码蛋白质的一级结构分析

Open Reading Frame Finder(https://www.ncbi. nlm.nih.gov/orffinder/)分析结果表明,该核苷酸序列含有一个长3960 bp的开放阅读框,可编码1319个氨基酸。氨基酸序列,见图2。

图2 贝酵母ADR1编码出的蛋白质序列Fig.2 A sequence of protein encoded by S.bayanus ADR1 gene

2.2.1 探讨贝酵母ADR1蛋白的理化性质 使用ExPASy(http://us.expasy.org/tools/protparam.html)软件分析该蛋白质,同时针对理化性和组成成分以进行详细分析。得出最终的蛋白质分子式为:C6664H10376N1822O2072S53,分子质量为150869.8,该蛋白质的理论pI值为6.40,表1中描述了该氨基酸的构成和各氨基酸的亲疏水性。在该条氨基酸上,共计有亮氨酸有141个,所占比例为10.7%,丝氨酸有147个,所占比例为11.10%,与其它氨基酸相比,这两者所占比例较高,该蛋白质不稳定系数为41.27,脂肪系数为77.92,总平均亲水性为-0.529,因此判定其为不稳定蛋白。

表1 贝酵母ADR1编码出的蛋白质中氨基酸的比例以及亲疏水性的分值Table 1 The proportion of amino acids and hydrophobic value of the proteins encoded by ADR1 gene

采用ProtScale(http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)进行蛋白质的亲水性分析。首先,可以从图3中了解到,依照20种氨基酸疏水特性的资料,具有较低负值的氨基酸的亲水性较强,而正值较高的氨基酸有着较强的疏水性[24]。按照正负值比例推测,该ADR1蛋白为亲水蛋白。图形所输出该ADR1蛋白最高分值与最低分值分别为2.956、-2.844,可能存在跨膜区。在124、246、485、501、578、814、876氨基酸位点附近的分值分别是-2.844、-2.544、-2.633、-2.844、-2.433、-2.544、-2.344,上述位点具有高亲水性,表明此区域可能存在折叠。

图3 ADR1编码蛋白质的亲水性Fig.3 The hydrophilicity of the protein encoded by the ADR1 gene

2.2.2 预测亚细胞定位与蛋白质信号肽 SignalP 3.0 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析预测结果见图4,不含有典型的信号肽区域。

图4 贝酵母ADR1蛋白信号肽预测Fig.4 Signal prediction by the ADR1 protein of S. bayanus

利用在线软件Targetp(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)软件进行分析,分析该蛋白质的亚细胞定位情况,具体可以从表2查看。该蛋白质具有0.054的可能性在线粒体内,有0.033的可能性在分泌通路内,同时,其他位置的可能性是0.966。也就是说该蛋白质可能存在于分泌通路以外或者线粒体以外的位置。从而证明,该蛋白质有可能是一种在细胞核中进行代谢调控的转录因子。

表2 贝酵母ADR1编码的蛋白质亚细胞定位情况Table 2 ADR1 encoded protein subcellular localization

2.2.3 激酶磷酸化修饰位点预测 通过KinasePhos(http://kinasephos2.mbc.nctu.edu.tw/index.html)在线分析工具来预测此蛋白质的修饰激酶与磷酸化位点,为了降低假阳性率,一旦该蛋白质的限定值超出百分之九十的范围的时候,在线工具提交时要全部选择这酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸和组氨酸四种蛋白质,具体预测情况如表3所示,潜在的磷酸化位点:丝氨酸(S)激酶潜在位点为27个、苏氨酸(T)激酶潜在位点为28个、酪氨酸(Y)激酶潜在位点为16个，可对修饰后的蛋白质功能的进行有极大促进效用。

表3 贝酵母ADR1基因编码出的蛋白质激酶磷酸化位点的预测情况Table 3 The prediction of protein kinase phosphorylation sites of ADR1

2.3 贝酵母ADR1基因编码蛋白质的二级结构预测

2.3.1 Coil区分析 基于lupas的测算方式,采用Coils(http://www. ch. embnet. org/software/COILS_form. html)在线分析工具,进行该蛋白质的卷曲螺旋的预测操作。详情可见图5。

图5 ADR1基因编码蛋白质的coil区分析图Fig.5 ADR1 gene encoding protein coil region analysis

这组蛋白质残基共包含Window 14、21、28三个不同的窗口,每一个窗口都可显示其卷曲螺旋的具体位置,但是文本数据并没有罗列。第一个卷曲螺旋序列位于18～43区域框内。

2.3.2 蛋白质的跨膜区及二级结构预测 通过TMPRED、TMHMM在线软件分别分析了研究该组蛋白质跨膜螺旋区,分析结查中均出现两个可能的跨膜螺旋区,此蛋白为典型的跨膜蛋白。通常蛋白质含有跨膜区,即可能作为膜受体、锚定蛋白或离子通道蛋白,均不溶于水,所以该预测蛋白质为水溶性蛋白。这与蛋白质的亲疏水性性质一致。TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测结果见图6。

图6 ADR1基因编码蛋白质的跨膜区分析图Fig.6 Transmembrane region analysis of ADR1 encoding proteins

借助预测的网站Predict Protein(http://www.predictprotein.org/)进行这组蛋白质的二级结构分析,结果表明该ADR1的二级结构中环占比65.72%,螺旋占比33.07%,折叠仅占比1.10%。

2.4 贝酵母ADR1基因编码蛋白质的结构域分析

借助Smart(http://smart.embl-heidelberg.de/)在线服务器对ADR1蛋白的结构域进行研究,详情如图7所示。该氨基酸序列之中,排在第106～126之间,第134～155位氨基酸位点出分别存在一个C2H2型锌指结构域。二级结构的预测表明螺旋(Helix)的比例为33.07%,可能是锌指结构的重要组成部分。

图7 分析ADR1编码出的蛋白质的结构域Fig.7 The structure domain analysis of protein encoded by ADR1 gene

采取prosite数据库(http://www.expasy.org/prosite)对这组蛋白质作出motif查询。详细信息见图8所示。其中“标尺”显示结构域的位置。这组蛋白质中,有两个地方和指定模板匹配,具体位置在第106～126位以及134～155位。都分别存在一个锌结构域。这种描述与之前提及的smart在线查询出的果一致。可以推测ADR1基因编码的蛋白很有可能是通过这2个C2H2型锌指结构域结合ADH2基因特异性,以此提升ADH2基因的表达,来提高贝酵母的酒精代谢能力。

图8 ADR1基因编码蛋白质的motif分析Fig.8 Motif analysis of protein encoded by ADR1 gene

2.5 贝酵母ADR1基因编码蛋白质的三级结构预测

预测贝酵母ADR1基因编码的蛋白质的三级结构,使用SWISS-MODEL(http://swissmodel. expasy. org/)在线预测软件,如图9所示，本文中的蛋白是基于Aart原子结构2i13.2的C链进行同源建模的,两者的序列一致性可以达到30.69%,GMQE值为0.03,GMQEAN值达到了-3.81,这些评分说明建模质量较好。此图清晰地表明该蛋白拥有跨膜区,是由主要是由卷曲和折叠加上少量螺旋所组成的,和二级结构的预测相符。分析结果可以得出预测的三级结构也拥有2个锌指结构域,这和二级结构的预测相同。

图9 ADR1基因编码蛋白质的三级结构预测结构图Fig.9 Tertiary structure prediction of protein encoded by ADR1 gene

2.6 ADR1序列比对分析

利用NCBI网站上的Blast工具对贝酵母ADR1基因进行同源检索,选取相似性大于78%部分菌株的ADR1 基因进行序列全长分析,通过检索对比发现,该基因与真贝酵母(S.eubayanus)ADR1基因同源性高达92%,与黄酒酵母(Saccharomycesarboricola)的ADR1基因为81%,与酿酒酵母YJM1402、YJM1273、R103、S288c、JAY291、P301等48个菌株的同源性为79%。较高的同源性说明该ADR1基因编码的蛋白质功能与酵母执行乙醇代谢的ADR1功能很相似,即有可能有调控乙醇脱氢酶的功能。

3 结论与讨论

本研究首次对贝酵母ADR1基因进行了克隆分析,从数据反馈可以知道,该核酸序列能够编码成一条有1319个氨基酸的蛋白质,分子式为C6664H10376N1822O2072S53,结构不稳定,属于亲水性蛋白,含两个跨膜结构域,在细胞核中亚细胞可发挥其的效用。除此之外,还包含C2H2锌指结构域,环结构比例排在首位的二级结构形态。预测它的三级结构也大致和二级结构相符。Hartshorne[25]和Blumberg[26]证明酵母ADR1基因有两个锌指结构的特征,而且必须拥有两个锌指结构才能正常执行ADR1基因的功能,本文通过结构域分析得出贝酵母ADR1基因含有两个锌指结构域和前人的研究相符,提升了我们结论的可靠性和对贝酵母功能推断的准确性。

酿酒酵母ADR1基因编码的蛋白质和贝酵母ADR1的基因编码蛋白质的性质基本一致。Denis和Young等[13,27-30]的研究表明酿酒酵母中ADR1基因是醇脱氢酶相关的乙醇代谢正向调节基因,也是酿酒酵母生长所必需的调控基因。实际上酿酒酵母ADR1基因所编码的蛋白质属于典型的亲水性蛋白,内里含有2个跨膜结构域,对细胞核活动会起到一定的影响。该蛋白质中的氨基酸序列有4处的coil区和两处跨膜区,ADR1基因所编码的蛋白质中含有两个C2H2型锌指结构域,而锌指结构域与DNA结合及基因调控有关。本研究结果与酿酒酵母ADR1基因的功能基本相符。当然,本文所推测的结论还需要后续进行功能确证等进一步验证。

从近年来国内外对植物或动物基因进行生物信息学分析的研究[31-34]不难发现在对生物基因进行生物信息学分析时,DNA序列比对法多用于比较蛋白序列,进而判定亲缘关系的远近,使结构和功能的分析、预测使研究更精确、全面和深入。本实验研究采用序列比对分析、结构比对分析和功能比对分析三种方法综合分析,首先对贝酵母ADR1基因进行测序,以得到其核苷酸序列,同时还要分析这组序列中的蛋白质,然后利用在线分析工具,了解该蛋白质的基本理化性质、跨膜区、coil区、亚细胞定位等。并且对该组蛋白质的二级和三级结构进行预测。因此,结果比较可靠。此外,本研究由蛋白质的结构和性质预测和推断其所行使的功能,以及如何影响细胞生长及代谢,为进一步研究贝酵母乙醇代谢的详细过程和途径奠定了一定的基础。

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