暗光缺氧条件下微囊藻的存活及胞内物质释放

陈桂钦 ,彭 琳 ,黄莹莹 ,李盼盼 ,张海春 ,陈雪初 ,3* (.华东师范大学生态与环境科学学院,上海000；.上海市环境监测中心,上海 00030；3.上海城市困难立地绿化工程技术研究中心,上海 003)

蓝藻水华爆发期间,沉降是影响水柱中蓝藻生物量的重要因素[1-4],研究显示沉降部分达到整个水柱蓝藻生物量损失的30%[5].沉降至底泥-水界面的蓝藻会受到暗光缺氧的胁迫.现有研究多集中在沉降蓝藻的越冬机制,冬季蓝藻通过形成休眠孢子[6],或者通过降低自身代谢水平来维持存活[7-10].然而,有研究显示夏季从底泥中分离出的蓝藻仍然存活并保持营养细胞状态,其酯酶活性甚至更高[11].表明夏季高温条件下,沉降蓝藻可能保持存活状态,但与冬季越冬行为有着完全不同的机制.与冬季休眠孢子保持低代谢水平不同的是,夏季沉降至底泥-水界面的蓝藻依然保持正常甚至更高的代谢水平,其代谢产物将会影响底泥-水界面物质的生物地球化学循环.

夏季沉降蓝藻在暗光缺氧胁迫下能够保持存活,为证明这一假说,本研究模拟暗光缺氧条件,利用不同生长期的微囊藻进行存活实验,并研究其有机碳、含氮物质及藻毒素的释放情况.

1 材料与方法

1.1 藻类培养

试验所用铜绿微囊藻(FACHB 942)购自中科院武汉水生生物研究所,培养温度为(25±1)℃,光照强度为 4000lx,光暗比为 14h:10h,培养基为BG11.根据图1所示生长曲线分别收集培养时间为12、28以及55d的微囊藻.取一定体积的藻液,以 4000r/min离心 10min,摒弃上清液,用无菌纯水洗涤后以4000r/min离心10min,重复3次,用于后续实验.

1.2 实验设置

实验条件设置为暗光缺氧.将清洗过的微囊藻用纯水进行稀释,12d组初始叶绿素 a (Chl a)浓度为 2.82mg/L,28d组初始 Chl a浓度为3.70mg/L,55d组初始Chl a浓度为4.20mg/L,每组设置 3个平行样.利用 N2吹脱去氧(溶解氧浓度低于0.5mg/L),在N2保护下将藻液加入到血清瓶中,顶空,用密封瓶盖密封瓶口,置于不透光黑色密封箱内,(25±1)℃条件下培养.该实验为破坏性实验,每3d随机取3个血清瓶进行测定,取样测定Chl a浓度、细胞存活率(Viable cell ratio)、释放物中溶解性总有机碳浓度(DOC)、溶解性总氮(DTN)浓度、氨氮浓度、藻毒素(MCs)浓度,之后该组血清瓶不再利用.

1.3 分析方法

叶绿素a浓度用AquaPen手持式藻类荧光测量仪(Photon Systems Instruments, spol.s r.o.,Czech Republic)测量,存活率采用细胞分析仪测定(The Muse®Cell Analyzer, EMD Millipore Corporation, Germany),氨氮采用APHA标准法[12]测定,DOC、TN用总有机碳分析仪(Multi N/C 3100, Analytik Jena, Germany)测量,藻毒素采用微囊藻毒素检测试剂盒(Express Technology Co.,Ltd)测定.

为了更好的表述数据,采用以下专用名词:(1)存活率,活体微囊藻细胞数量占总细胞数量的比例; (2)单位叶绿素的DOC释放量(mg C/mg Chl a),即为单位叶绿素的微囊藻释放出 DOC的量,计算方法为将细胞释放 DOC浓度(mg/L)除以Chl a浓度(mg/L); (3)单位叶绿素的DTN释放量(mg N/mg Chl a),即为单位叶绿素的微囊藻释放出DTN的量,计算方法为将细胞释放DTN浓度(mg/L)除以Chl a浓度(mg/L); (4)单位叶绿素的MCs释放量(mg MCs/mg Chl a),即为单位叶绿素的微囊藻释放出 MCs的量,计算方法为将细胞释放MCs浓度(mg/L)除以Chl a浓度(mg/L).实验组和对照组参数采用方差分析法(ANOVA)分析比较.

2 结果与讨论

2.1 暗光缺氧条件下微囊藻细胞存活率及生物量变化

图2为暗光缺氧条件下微囊藻存活率变化.细胞存活率可以直接表征微囊藻的存活情况,由图可知,在暗光缺氧条件下,短期内细胞能够维持较高存活率,之后迅速降低.其中28d组存活率降低最快,实验第 6d降至 6.51%;而此时 55d组存活率仍然较高,为 84.08%;12d组则处于中等水平,实验第6d存活率为32.99%.可知在暗光缺氧胁迫下,55d及 12d组存活时间可达 6d以上,28d组存活时间较短,低于 6d.总体而言,暗光缺氧胁迫下,藻细胞的存活时间 28d组<12d组<55d组.图3为暗光缺氧条件下Chl a浓度在9d内的变化,用Chl a浓度表征微囊藻生物量.结果显示,28d组 Chl a浓度降低较快,6d后由3.69mg/L降至2.27mg/L,此时12d和55d组Chl a浓度与初始值相比没有明显降低,第 9d两组的Chl a浓度开始降低.微囊藻Chl a的变化与其存活率变化相对应.

研究发现夏季水华期会有大量蓝藻沉降至暗光缺氧的底泥-水界面[1-4].在黑暗和低温条件下,微囊藻生长受到明显抑制,N充足但黑暗条件下25d后微囊藻衰亡[13].陈雪初等[14]研究发现在23℃时,当光照度小于 500lx,微囊藻的生长会受到明显抑制.Furusato等[10]研究表明经过 10d的黑暗限制之后,微囊藻生物量显著下降,20d后降至初始细胞数量的1%.Shi等[15]研究发现在黑暗条件下,微囊藻比斜生栅藻适应能力更强,其细胞新陈代谢略微上升,且没有明显的细胞死亡.以上研究可知微囊藻在暗光环境下可以长期存活达20d左右,且代谢率并没有大幅下降.本文研究发现,在模拟夏季底泥-水界面条件下,不添加氮源时微囊藻细胞可以存活达9d,表明微囊藻在暗光无氧的条件下仍然可以保持存活状态.

图1 微囊藻生长曲线Fig.1 The Growth curve of Microcystis

图2 暗光缺氧条件下微囊藻存活率的变化Fig.2 Changes of the viable cell ratio under the dark/anoxic condition

图3 暗光缺氧条件下微囊藻叶绿素浓度的变化Fig.3 Changes of Chlorophyll a concentration of Microcystis under the dark/anoxic condition

2.2 暗光缺氧条件下微囊藻DOC的释放

由图4可知,在实验第3d,各实验组细胞存活率均在80%以上,此时28d组的单位叶绿素DOC释放量最高,达到1.86mg C/mg Chl a,12d及55d组分别为0.54、0.94mg C/mg Chl a.单位叶绿素DOC释放量12d组<55d组<28d组.微囊藻存活率变化表明,12d和28d组微囊藻在实验第3d时存活率在 90%以上,此时其 DOC释放曲线斜率较小,3d之后细胞存活率迅速下降,而DOC释放曲线斜率也同时增大.55d组微囊藻在实验第 6d之后存活率降低,DOC释放曲线的斜率同步增加.这表明,细胞存活率较高时,虽然会有部分死亡细胞分解释放DOC,但此时大部分有机碳等是存活微囊藻在代谢过程中释放的,一旦细胞死亡释放有机碳,其浓度会迅速增加.表明微囊藻细胞不仅在死亡分解时能释放有机碳,在存活的情况下依然可以释放有机碳.表明暗光缺氧条件下,存活的微囊藻能够释放有机碳.现有研究发现太湖水体中胶体有积碳浓度为 1.79～2.05mg/L,占DOC的8.11%～22.13%[16].朱元荣[17]研究发现微囊藻水体中 TOC的主要物质为氨基酸.孔繁翔[18]的研究结果表明巢湖水体中总溶解性碳水化合物占(总有机碳)TOC的比例最高为 26%,多糖和单糖所占比例分别为 21%和 6%.藻细胞能够通过光合作用固定无机碳,现有研究已经证明沉降蓝藻死亡分解会释放大量有机碳,从而促进水体生物脱氮作用[19-21],但目前少有研究关注活藻与底泥-水界面氮脱除之间的关系.本研究发现活藻同样也会释放有机碳,在暗光缺氧条件下,存活微囊藻细胞单位叶绿素的DOC释放量可达到1.86mg C/mg Chl a.

研究结果显示,在暗光缺氧条件下,细胞的存活和有机物释放与其生长阶段有关.现有研究表明,对数生长阶段的藻细胞具有体积小,细胞壁薄,贮存物质少等特征[22].在此阶段,细胞代谢活性最强,组成新细胞物质最快,同时对理化因素影响敏感.进入稳定期后,细胞开始积累贮藏物质,这一时期细胞数量达到了最高水平,产物积累也达到了高峰[23].本文使用培养了12、28及55d的微囊藻作为研究对象,图 1生长曲线表明其分别处于对数期、稳定初期及稳定后期.结果表明,实验第3d时,在暗光缺氧胁迫下28d组微囊藻DOC释放量最高.这可能与藻细胞进入稳定期后,细胞内贮藏物质开始积累有关[24-25].培养 12d微囊藻处于对数期,藻细胞代谢活性最强,并且易受理化因素影响,细胞贮藏物质较少[22],其存活时间较稳定后期短,其胞外 DOC释放也相应的较少.培养 55d微囊藻处于稳定后期,藻细胞内贮藏物质积累较多,同时其细胞代谢较对数期低[26],在暗光缺氧胁迫下可以存活相对较长的时间,DOC的释放量处于中间水平,低于稳定初期,但高于对数生长期.

图4 暗光缺氧条件下微囊藻DOC释放Fig.4 Changes of DOC secreted by Microcystis under the dark/anoxic condition

2.3 暗光缺氧条件下微囊藻氮素的释放

图5显示暗光缺氧条件下微囊藻氮素的释放量逐渐增加.实验第 3d,不同培养时间微囊藻的单位叶绿素 DTN 释放量差别不大,均较低,而此时12d和55d组的单位叶绿素氨氮释放量较高,尤其是12d组,其氨氮释放量达到0.09mg N/mg Chl a;实验第6d, 单位叶绿素DTN释放量增加,与DOC释放情况不同的是,12d组的TN释放量最高,而存活率较高的两组(12d和55d)氨氮释放量相对较高.实验结果表明存活微囊藻也能够释放氮素,但其释放物的C/N较高,为3.00～7.83,表明暗光缺氧条件下微囊藻释放的氮素利用自身释放的 DOC即可通过生物反硝化过程去除,不会对水体产生额外的氮负荷.而相较于死藻,活藻有机会由于自身浮力调控机制或水体扰动(大风、湍流等)而重新上浮至真光层[27-29],通过光合作用重新积累有机碳,从而持续影响生物脱氮过程.

根据存活实验结果及氨氮释放情况推测,夏季沉降蓝藻可能存在与越冬不同的存活机制,硝酸盐异化还原成铵(DNRA)可能是微囊藻细胞保持存活的途径之一.DNRA是将硝态氮转化为可生物再利用的铵盐[30].Kamp等[31]的研究表明硅藻可以利用细胞内的NO3-进行DNRA,从而可以在黑暗无氧的环境下长期存活.本研究表明,培养液中氨氮浓度呈上升趋势,且12d和55d组细胞培养液中氨氮浓度较28d组高,相对应的12d和55d组细胞的存活率也较高.由此推测,暗光缺氧条件下微囊藻可能存在与海洋硅藻相类似的存活机制,即依靠DNRA过程来获得能量从而维持生命活动,这一推测需要进一步研究.

图5 暗光缺氧条件下微囊藻氮素释放Fig.5 Changes of nitrogen secreted by Microcystis under the dark/anoxic condition(a):溶解性总氮;(b):氨氮

2.4 暗光缺氧条件下微囊藻毒素的释放

图6表明,实验第3d,各组单位叶绿素藻毒素释放量较低,均低于 8.73µg MCs/mg Chl a.实验第 6d,55d组藻毒素释放量最高,为 18.84µg MCs/mg Chl a;12d组藻毒素释放量最低,为2.73µg MCs/mg Chl a.各组藻毒素释放量随着细胞存活率的降低而增加,其中 55d组藻毒素释放量增加较大,另外两组增加平缓.现有研究表明,夏季水体中蓝藻沉降量能达到 15.00mg Chl a/m2[4-5],根据图 6计算藻毒素释放量低于 270µg MCs/m2,若水体深度为 2m,则释放藻毒素浓度仅为 0.14µg/L,不会引起对水体中藻毒素浓度的急剧增加.

图6 暗光缺氧条件下微囊藻毒素释放Fig.6 Changes of MCs secreted by Microcystis under the dark/anoxic condition

3 结论

3.1 暗光缺氧胁迫下,微囊藻细胞能够存活一段时间,而不同生长期的藻细胞存活时间不同,其中培养 55d的微囊藻存活时间最长,超过 6d;Chl a的变化与其存活率相对应,但变化程度较小.

3.2 暗光缺氧条件下,微囊藻能够持续释放有机碳、含氮化合物以及藻毒素等物质,且物质释放量与其生长期相关.存活微囊藻细胞 DOC释放量可达到 1.86mg C/mg Chl a,氨氮释放量为0.09mg N/mg Chl a,释放物的 C/N 较高,为3.00～7.83.

3.4 暗光缺氧条件下,微囊藻释放出的藻毒素均低于8.73µg MCs/mg Chl a.

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