中药皮炎片对变应性接触性皮炎(ACD)模型小鼠的保护作用及机制研究

刘 萍， 胡士玲， 李一涵， 卞艺斐， 刘钟杰

(中国农业大学动物医学院， 北京 海淀 100193)

中药皮炎片是治疗变应性接触性皮炎的中兽药，全方祛风利湿、活血疏经、清热滋阴。 此方由当归、金银花、黄芩、茯苓、白花蛇舌草等27 味中药组成。 本研究对中药皮炎片进行一系列药效学试验，以探讨其抗炎机理。

1 材料与方法

1.1 主要材料 中药皮炎片，天津市保灵动物保健品有限公司；氯雷他定片，西安杨森制药有限公司；2，4-二硝基氯苯、丙酮，国药集团化学试剂有限公司；小鼠IL-4(HY-077)、IFN-γ(HY-1013)放免试剂盒，北京华英生物技术研究所。

1.2 中兽药皮炎片、氯雷他定和DNCB 溶液的配制 皮炎片研磨成粉，蒸馏水溶解，配成1 g/mL 母液；氯雷他定(10 mg/片)50 mL 蒸馏水溶解，配成0.2 mg/mL 溶液；DNCB 溶解于丙酮与橄榄油(4∶1)溶液，配制成7% 和0.5% DNCB 溶液。 所有溶液4 ℃保存，临用前37 ℃水浴加热5 min。

1.3 实验动物 SPF 级8 周龄BALB/c 雌性小鼠，体重18 ～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。 饲养于独立通风笼具系统。 试验前饲养于独立通风笼具系统1 周，自由摄食饮水，消除应激。

1.4 ACD 小鼠模型的建立 致敏前1 d，剃净小鼠腹部体毛，暴露部分皮肤，剃毛面积2 cm ×2 cm。致敏第1 天，取10 μL 7%DNCB 溶液均匀涂抹在皮肤暴露处。 第2 天强化致敏1 次；作为对照，第4 天暴露小鼠背部皮肤2 cm ×2 cm。 第5 天取100 μL 0.5%DNCB 溶液均匀涂抹小鼠的背部皮肤暴露处。以后每隔3 d 相同致敏剂量和方法激发背、腹部皮肤4 次(8 d，11 d，14 d，17 d)。

1.5 实验动物分组与处理 小鼠随机分为7 组，每组8 只。 分别为：空白对照组(CON)、模型对照组(ACD)、皮炎片0.3 g/kg·bw 剂量组(P1)、皮炎片0.6 g/kg·bw 剂量组(P2)、皮炎片0.9 g/kg·bw剂量组(P3)、皮炎片1.2 g/kg·bw 剂量组(P4)、氯雷他定对照组(Loratadine)。 致敏前1 d 对中药各组和Loratadine 组小鼠相应药物灌胃，CON 组、ACD组小鼠蒸馏水灌胃。 1 日两次(8：00、20：00)，每次200 μL，持续18 d。 ACD 组、Loratadine 组和中药各组小鼠行ACD 造模，CON 组取丙酮-橄榄油(4∶1)溶液对照。 第17 d，观察各组小鼠皮损情况、称重并记录。眼球采血4 ℃静置2 h，4 000 r/min(4 ℃)离心10 min，取上清-20 ℃保存。 完整摘取脾脏、胸腺，称重，取背部皮肤、肝脏、肾脏，用于后期病理学检验。

1.6 检测指标与方法 背部皮损情况评分标准：明显红斑、水肿、渗出或明显角化结痂者记3 分；轻度红斑、水肿、渗出不明显或中度角化者记2 分；红斑、水肿、渗出均不明显或轻度角化者记1 分；正常皮肤记0 分。 脾指数、胸腺指数测量与计算：电子天平称量记录脾脏、胸腺重量。 分别以每10 g 小鼠的脾重(mg)与胸腺重(mg)作为脾指数与胸腺指数。 皮肤及肝肾病理学观察：小鼠背部剪毛处皮肤、肝脏和肾脏组织于中性甲醛中固定24 h，更换固定液，继续固定3 ～4 d 后，进行后续切片制作。 血清IL-4、IFN-γ 含量测定：按试剂盒说明书操作。1.7 数据处理 SPSS17.0 软件对试验结果进行分析处理。 试验数据以平均值± 标准误(Mean ±SEM)表示，单因素方差分析(One-way ANOVA)检验试验组间差异性。 P ＜0.05 为差异有统计学意义。 (皮炎片各组与氯雷他定组间以P ＞0.05 为有统计学意义)

2 结果

2.1 中药皮炎片对ACD 小鼠背部皮损评分的影响

剖检发现ACD 组和P1、P2 组小鼠背部脱毛、红斑、结痂等症状明显；P3、P4 组和Loratadine 组的背部有部分红斑和极少量结痂，被毛重新生长。 背部皮损评分结果(图1)可见，ACD 组皮损评分显著性高于空白对照组(P ＜0.05)；P3、P4 组及Loratadine组皮损评分显著性低于ACD 组(P ＜0.05)；P3、P4组皮损评分与Loratadine 组差异不显著(P ＞0.05)。

图1 背部皮损评分

2.2 中药皮炎片对ACD 小鼠脾指数、胸腺指数的影响 从图2 可见，ACD 组脾指数显著性高于空白对照组(P ＜0.05)；P3、P4、Loratadine 组脾指数显著性低于ACD 组(P ＜0.05)；P3、P4 组脾指数与Loratadine 组差异不显著(P ＞0.05)。 从图3 可见，ACD组胸腺指数显著高于空白对照组(P ＜0.05)；P3、Loratadine 组胸腺指数显著低于ACD 组(P ＜0.05)；P1、P2、P3、P4 组胸腺指数与Loratadine 组差异不显著(P ＞0.05)。

2.3 背部皮肤病理学观察 从中插彩版图4 可见，P1 组(a)大量炎性细胞浸润，表皮棘层轻微变厚。P2 组(b)大量炎性细胞浸润，表皮棘层增生4-6 层细胞，皮肤表皮角化不完全。 P3 组(c)无明显炎性细胞浸润，表皮棘层为1-3 层细胞，符合正常皮肤结构。 P4 组(d)和Loratadine 组(f)少量炎性细胞浸润，明显少于P1 组和P2 组。

2.4 中药皮炎片对血清IFN-γ 和IL-4 含量的影响

2.4.1 血清IFN-γ 变化 从图5 可见，ACD 组血清IFNγ 的含量显著低于空白对照组(P ＜0.05)；P3、P4 组血清IFN-γ 含量显著高于ACD 组(P ＜0.05)。 P1、P2 组血清IFN-γ 的含量与Loratadine 组差异不显著(P ＞0.05)。

图2 脾指数评分

图3 胸腺指数评分

图5 血清IFN-γ 含量

2.4.2 血清IL-4 变化 从图6 可见，ACD 组血清IL-4 含量显著高于空白对照组(P ＜0.05)；P4 组血清IL-4 含量显著低于ACD 组(P ＜0.05)；P2、P3、P4 组血清IL-4 含量与Loratadine 组差异不显著(P ＞0.05)。

2.5 中药皮炎片对ACD 小鼠的肝肾形态学影响

图6 血清IL-4 含量

2.5.1 肝脏病理变化 剖检时各组小鼠肝脏未见明显异常。 肝脏组织切片H. E. 染色结果(见中插彩版图7)显示，P4 组(d)肝小叶间有少量的血细胞浸润，肝细胞轮廓模糊，细胞轻微肿胀。 其余各组肝脏未出现明显的病变。

2.5.2 小鼠肾脏病理变化 剖检发现P4 组小鼠肾脏轻度充血。 其余组肾脏未见明显异常。 组织H.E.染色结果(见中插彩版图8)表明：CON 组、Loratadine 组细胞轮廓明显，结构清晰，未见明显异常。P4 组(d)细胞结构松散，轮廓不清晰，肾小球肿胀，无法明显区分肾小囊结构，伴有少量细胞裂解。

3 讨论

兽医临床上犬猫变应性接触性皮炎较为常见。变应性接触性皮炎(Allergic contact dermatitis，ACD)是一种由低分子量有机物或金属离子引起免疫系统发生不良反应的皮肤性疾病，属于典型Ⅳ型超敏反应[1]。 临床表现多为湿疹样皮损， 急性期为红斑、丘疹或水疱、渗出； 慢性期为皮肤苔藓样变、鳞屑、皲裂。 ACD 的发生与性别、年龄、皮肤多汗、皮脂多、遗传背景及环境因素[2]等有关。 致敏性T 淋巴细胞与抗原结合，大量炎性因子释放，大量单核细胞浸润甚至组织变性坏死[3]。 当前针对犬猫变应性接触性皮炎的药物主要是糖皮质激素和抗组胺药物，虽短期抑制皮炎作用明显，但普遍需长时间服药，病情易反复，副作用较大，如皮肤色素沉着、萎缩和向心性肥胖[4]等。 中医普遍认为皮炎类疾病由风、热、湿三邪致病，虽有诸多证型且发病机理各不相同，但通常都有红斑、红疹、皮肤瘙痒、水泡等表现，治疗上以祛风止痒、清热利湿为原则[5]。皮炎片全方祛风利湿、活血疏经、清热滋阴，君药为当归、金银花、黄芩、茯苓。 当归补血养血，活血止痛；金银花清热解毒、散热疏风；黄芩清热燥湿、泻火解毒；茯苓利尿渗湿、健脾宁心[6]。

对照组小鼠被毛逐渐生长，而ACD 模型小鼠被毛杂乱、脱落形成红斑，部分角质化、结痂、脓疱，表现不同程度精神沉郁，搔扒致敏部位。 病理检查发现，表皮厚度增加、细胞轻度角质化，表皮与真皮均有大量炎性细胞浸润。 说明本试验成功建立DNCB致小鼠ACD 模型。 为了进一步研究皮炎片对ACD模型小鼠的治疗作用，我们使用皮损积分和皮损处组织病理变化评估皮损情况，衡量皮肤炎症和病变程度；测量小鼠胸腺指数、脾指数判断皮炎片对ACD 引发的超敏反应的抑制程度；检测小鼠血清IL-4、IFN-γ含量，判断Th1、Th2 细胞亚群免疫平衡情况，进一步评估皮炎片对ACD 治疗的有效性。 我们采用ACD治疗常用药氯雷他定作为阳性对照，对比皮炎片各剂量组(0.3、0.6、0.9、1.2 g/kg·bw)与氯雷他定组(2 mg/kg·bw)对小鼠ACD 的治疗作用。

皮炎片给药剂量较低(0.3 g/kg·bw、0.6 g/kg·bw)时，小鼠ACD 症状无明显缓解，皮损积分无明显变化。 病理学检查佐证低剂量皮炎片小鼠皮损处炎性反应较明显；高剂量(0.9 g/kg·bw、1.2 g/kg·bw)皮炎片和氯雷他定组小鼠背部红斑、结痂消失，被毛生长，皮损指数明显降低。 结果佐证高剂量皮炎片有显著抗炎作用。 0.9 g/kg·bw、1.2 g/kg·bw 剂量皮炎片给药能明显抑制小鼠胸腺和脾肿胀，降低胸腺和脾指数，证明中药皮炎片对免疫功能的维护有一定的作用；胸腺和脾脏作为动物机体重要免疫器官，评价脾指数和胸腺指数对小鼠ACD 恢复程度评判有重要意义。 当机体发生超敏反应，脾脏和胸腺发生肿胀，重量增加。 0.9 g/kg·bw、1.2 g/kg·bw 剂量皮炎片显著下调ACD 小鼠血清IL-4 水平，上调IFN-γ 水平，能有效调节Th1和Th2 细胞亚群之间的免疫平衡。 在ACD 发病进程中，Th1 和Th2 亚群的动态变化反映了中药皮炎片对小鼠体内炎症的有效调控程度。 IFN-γ、IL-4 是Th1 和Th2 细胞亚群中具有代表性的细胞因子[7-8]，二者含量能有效反映Th1 细胞和Th2 细胞的平衡态。 我们评估了高浓度给药条件下小鼠肝脏、肾脏损伤情况。 结果表明，1.2 g/kg·bw 剂量皮炎片组小鼠肾脏轻度充血，表现急性肾炎症状，肝脏轻微病变。 可初步得出结论，高剂量长期服用皮炎片，对肾脏、肝脏造成一定损伤。

0.9 g/kg·bw 剂量中药皮炎片能显著缓解小鼠ACD 皮炎症状，上调IFN-γ 水平，下调IL-4 水平，有效调节Th1 和Th2 细胞亚群平衡。 有研究表明，皮炎片君药当归主要成分APS 可调节Th1 和Th2亚群细胞的平衡[9]，有效促进特异性免疫和非特异性免疫；白花蛇舌草多糖能显著升高羊红细胞攻瑰花斑结合率和淋巴母细胞转换率[10]；蝉蜕有明显免疫抑制作用[11]；茯苓多糖能有效增强机体免疫功能[12]；黄芪多糖明显增加脾脏、胸腺重量，提高吞噬细胞吞噬能力[13]。 这些有效成分可能是皮炎片发挥抗炎作用，有效治疗变应性接触性皮炎的主要原因。 建议后续研究中可针对其皮炎片主要活性成分、安全性检测和毒理学研究做进一步探讨。