NaCl处理对酸枣幼苗内源激素含量的影响

涂文文，鲁晓燕，王晓丽，白茹

(石河子大学农学院/特色果蔬栽培生理与种质资源利用兵团重点实验室， 新疆石河子 832000)

0 引 言

【研究意义】新疆土壤盐碱化严重[1]，截止2015年，新疆总耕地面积4 124 563公顷，盐碱地面积204 501公顷[2]，盐碱地面积占总耕地面积4.96%。土壤盐碱化不仅导致土壤生产力降低，而且引发诸多生态环境问题，是制约新疆农业生产的重要因素之一 。大部分植物在土壤含盐量为0.3% 时受到危害，大于 0.5% 时即不能生长[3]。枣树是原产于我国的特有果树，在我国栽培历史悠久，分布广泛[4]。枣树结果早，寿命长，管理方便，收益快，具有重要的经济价值和生态价值[5]。新疆枣树种植总面积495 548公顷[2]，在盐碱地上栽培的枣树存在缺苗、生长量减少、产量和品质下降等不同程度的盐害症状，影响了新疆枣产业的发展[6]。优质枣树主要靠嫁接繁殖，其耐盐性主要取决于砧木，酸枣(ZiziphusjujubaMill)具有抗干旱、耐盐碱的特性，常用作枣的优良砧木[7]。植物的内源激素包括生长素(growth substance，IAA)、脱落酸(abscisic acid，ABA)、赤霉素(gibberellin，GA3)、玉米素(zeatin，ZT)等，植物内源激素与盐胁迫的生理响应关系密切，研究NaCl处理对酸枣幼苗内源激素的影响，对酸枣的耐盐机理和新疆盐碱地资源的利用有重要意义。【前人研究进展】盐胁迫下小麦幼苗[8]、杨树嫩茎质外体[9]、ABA的含量增加，多数植物在盐胁迫下表现出不同程度的 ABA 积累[10]。Munns和Sharp[11]认为，在盐胁迫下ABA 作为最初调节过程的信号调节植物对盐胁迫的适应性反应。短期盐胁迫下植物生长主要受根部盐渗透的影响 ，叶片生长受 ABA 的调节[12]，盐胁迫促进了ABA 和乙烯的合成，抑制了 IAA、CK、ZR的合成，激素之间通过相互协调共同调控植物的生长发育及胁迫后的生理生化反应[13]，作为衡量信号的植物内源激素与植物耐盐性的关系一直是植物抗盐机理研究的主要内容。前期以酸枣为材料，研究了不同浓度NaCl胁迫对幼苗活性氧、细胞膜透性、根系活力、不同器官离子含量的影响[14]，以及NaCl胁迫对酸枣幼苗AsA-GSH循环的影响[15]。【本研究切入点】目前对于酸枣幼苗内源激素与耐盐性关系的研究少有涉及。研究NaCl处理对酸枣幼苗内源激素含量的影响。【拟解决的关键问题】通过研究NaCl处理对酸枣幼苗内源激素含量的影响，为解析酸枣的耐盐机理和新疆盐碱地资源的利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验在石河子大学农学院进行。供试材料选用酸枣种子，挑选大小一致，健康饱满的酸枣种子，室温下清水浸泡24 h以促进发芽。用0.5% KMnO4消毒30 min，置于人工气候箱(RXZ智能型，宁波江南仪器厂)中培养，光照强度12 000 lx，光照时间14 h，黑暗时间10 h；相对湿度65%～70%；温度25～28℃。发芽盒内加入蒸馏水以维持种子湿润，待幼苗长出2片真叶后，选择长势均一的幼苗用2 cm厚的泡沫板悬浮于水培盒中。水培盒大小为19 cm×13 cm×11 cm(长×宽×高)。每个水培盒加1倍日本园试配方营养液500 mL，每3 d更换一次营养液。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

幼苗长到6片真叶时，挑选根系健壮且生长一致的幼苗进行处理。(1)对照：日本园试配方营养液；(2)日本园试配方营养液加50 mmol/L NaCl；(3)日本园试配方营养液加100 mmol/L NaCl；(4)日本园试配方营养液加150 mmol/L NaCl；(5)日本园试配方营养液加200 mmol/L NaCl。每个处理重复3次，每个重复15株幼苗。为避免盐激反应，NaCl浓度以每天50 mmol/L的梯度逐步递增，全部处理于同1 d达到目标浓度，设此时为NaCl处理第0 h。在处理第0、6、12、24、48、96和144 h进行取样，取样完毕后放入-80℃冰箱保存，用于激素含量的测定。

1.2.2 HPLC 流动相的选择

高效液相色谱仪(LC-2010AHT，日本岛津)，离心机(HITACHI，CR22GIE)，旋转蒸发器(RE-2000A)。玉米素、赤霉素、生长素、ABA标准品购自Sigma公司，甲醇、乙酸为色谱级，乙酸乙酯、盐酸、磷酸氢二钠、交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)为分析纯，试验用水为超纯水。所有试剂使用前均通过0.45 μm微孔滤膜过滤。

HPLC条件：AgilentC18ZORBAX反向色谱柱(150 mm×46 mm，5 μm)；柱温：35℃；流速：1 mL/min；进样量：10 μL；采用切换波长法以外标法进行定量测定；流动相V(甲醇)∶V(超纯水含1 %乙酸)=47∶53。

1.2.3 标准品的配置

分别称取0.005 g ZT、0.01 g IAA、0.125 g GA3和0.005 g ABA标准品，用纯甲醇溶解并定容至50 mL棕色容量瓶，即为4种激素混合标准溶液。以混合标准溶液为母液，逐级稀释，配制成含有ZT、GA3、IAA和ABA的系列标准溶液，采用优化的色谱条件，依次进样检测，以激素质量浓度(ng/mL)为横坐标，以峰面积(mAU)为纵坐标，建立4种激素的回归方程。

标准曲线的绘制：混合标准品用50 mL 100%甲醇溶解，吸取25 mL上述混合标准品溶液加入25 mL甲醇稀释，依次吸取前一步标准品溶液加入25 mL甲醇稀释，依次稀释3次，形成5个浓度，测出每个浓度的峰面积，从而计算出各个激素含量，绘制标准曲线。

1.2.4 测定指标

准确称取0.2 g冷藏的酸枣材料，加入10 mL预冷的80%甲醇和液氮研磨成匀浆，密封后置于4℃冰箱静置不同时间，4℃条件下10 000 r/min离心10 min后取上清液，残渣加入80%甲醇离心重复3次合并上清液，将全部的上清液于40℃条件下旋蒸至原体积的1/3(每次旋蒸样品时要用注射器吸取旋蒸瓶内残留的提取液减小误差)将余下的提取液用Na2HPO4调pH=8，加入30 mL的石油醚脱色3次，弃醚相，再加入0.1的PVPP，震荡30 min后过滤。将滤液用0.1的HCL调整pH=3，加20 mL乙酸乙酯涡旋后静置5 min，待分层后，取上层酯相，重复萃取4次合并酯相。将合并的酯相在40℃条件下减压蒸干，残留物加2 mL的乙酸溶解3次后将溶解液过sep-pak18小柱纯化，用甲醇洗脱后再40℃条件下减压蒸干，用80%甲醇溶解定容至2 mL溶液(每次溶解样品时要用注射器吸取旋蒸瓶内残留的溶解混合液减小误差)过0.45 μm的微孔滤膜后HPLC分析，计算出ABA、GA3、IAA、ZT的峰面积，从而计算出ABA、GA3、IAA、ZT的含量。

1.3 数据处理

利用Origin 8和Spass 17.0软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1不同浓度NaCl处理对酸枣幼苗叶，根ABA含量的影响

研究表明，与对照相比，50、100、150和200 mmol/L NaCl处理0 h，酸枣幼苗叶和根中ABA含量均无显著变化； NaCl处理6 h，酸枣叶中ABA含量均显著升高，分别是对照的1.61、2.24、2.74、3.51倍，根中的ABA的含量只有150和200 mmol/L高于对照，分别是对照的17.04、22.31倍。 NaCl处理12、24、48、96和144 h，50、100、150和200 mmol/L酸枣幼苗叶和根中ABA含量均显著高于对照，增幅最大的分别是200 mmol/L NaCl处理的酸枣幼苗叶和根中ABA含量。并且在NaCl处理96和144 h，随着NaCl浓度的增加，酸枣苗叶和根中ABA的含量均增加，不同浓度之间差异显著。

与0 h相比，在50、100、150和200 mmol/L NaCl处理下，随处理时间的延长酸枣叶片和根的ABA含量显著上升。在50、100、150和200 mmol/L NaCl处理144 h酸枣叶片ABA含量分别是0 h的5.21、5.75、5.09、4.73倍，根中ABA含量分别是0 h的15.73、8.73、4.82、3.71倍。100、150和200 mmol/L NaCl处理下，随着处理时间点的增大，酸枣幼苗根和叶中ABA的含量均增加，在144 h ABA的含量增加最显著，不同时间点之间差异显著。图1

注：不同小写字母表示同一时间不同浓度间的显著水平(P<0.05， n=3)， 不同大写字母表示同一浓度不同时间点的显著水平(P<0.05， n=3)下同

Note:

图1 酸枣叶、根在NaCl处理下ABA含量变化
Fig.1 Effect of NaCl treatment on ABA in leaves and roots of sour jujube seedlings

2.2不同浓度NaCl处理对酸枣叶，根GA3含量的影响

研究表明，与对照相比，50、100、150和200 mmol/L NaCl处理6、12、24、48、96和144 h酸枣幼苗叶和根的GA3含量显著下降，随着浓度的升高下降幅度增加，并且同一时间点不同浓度之间差异显著。酸枣幼苗在50、100、150、200 mmol/L NaCl处理0 h叶片中GA3含量降幅分别为5.32%、14.38%、22.10%、29.59%，根中GA3含量降幅分别为9.29%、31.91%、40.33%、62.77%；酸枣幼苗在50、100、150和200 mmol/L NaCl处理144 h叶中GA3含量的降幅分别为36.33%、49.41%、41.42%、58.60%，根中GA3含量降幅分别为15.38%、65.50%、32.15%、73.71%，同一处理时间与对照相比，200 mmol/L NaCl处理时下降最显著。

与0 h相比，酸枣叶和根在50、100、200 mmol/L NaCl处理下随时间的延长GA3含量整体显著降低，处理144 h叶中GA3含量的降幅分别为24.35%、33.53%、33.84%，根中降幅分别为16.49%、54.64%、36.79%；酸枣幼苗叶在0 mmol/L NaCl处理下随时间点的增大GA3含量整体显著增加，酸枣幼苗根相同处理下GA3含量整体显著降低；酸枣幼苗根在150 mmol/L NaCl处理144 h的GA3含量显著升高。图2

图2 酸枣叶、根在NaCl处理下GA3含量变化

2.3不同浓度NaCl处理对酸枣幼苗叶，根ZT含量的影响

研究表明，与对照相比，100、150和200 mmol/L NaCl处理6 h酸枣幼苗叶中ZT含量显著下降，降幅分别是24.23%、34.78%、52.40%；100、150和200 mmol/L NaCl处理6 h酸枣幼苗根中ZT含量显著下降，降幅分别是18.56%、34.56%、42.14%。 100、150和200 mmol/L NaCl处理144 h酸枣幼苗叶中ZT含量的降幅分别为61.69%、72.01%、78.04%，酸枣幼苗根中ZT含量的降幅分别为38.16%、44.57%、67.46%；酸枣幼苗叶在50 mmol/L NaCl处理0、6、12、24和48 h ZT含量显著高于对照，在96、144 h时显著低于对照。酸枣幼苗叶和根在100、150和200 mmol/L NaCl处理6、12、24、48、96和144 h ZT含量显著下降，同一处理时间与对照相比，200 mmol/L NaCl处理时下降最显著。

与0 h相比，酸枣叶在100、150、200 mmol/L NaCl处理下随时间的延长ZT含量整体显著降低，144与0 h相比叶中ZT含量的降幅分别47.28%、46.31%、50.18%，在150、200 mmol/L NaCl处理时幼苗根ZT含量整体显著下降，降幅分别为8.05%、38.00%。图3

图3 酸枣叶、根在NaCl处理下玉米素含量随时间变化
Fig.3 Effect of NaCl treatment on ZT in leaves and of sour jujube seedlings

2.4不同浓度NaCl处理对酸枣幼苗叶，根IAA含量的影响

研究表明，与对照相比，在6、12、24、48、96和144 h，100、150、200 mmol/L NaCl处理时酸枣幼苗叶和根的IAA含量显著降低，在6 h，50、100、150、200 mmol/L NaCl处理下酸枣幼苗叶IAA含量的降幅分别是 17.38%、29.88%、47.36%、59.63%，酸枣幼苗根中IAA含量的降幅分别是10.16%、17.56%、41.6%、51.63%，在144 h，50、100、150、200 mmol/L NaCl处理下酸枣幼苗叶IAA含量的降幅分别是21.13%、40.40%、44.67%、51.61%，酸枣幼苗根IAA含量的降幅分别是28.46%、46.61%、52.56%、58.77%，同一处理时间与对照相比，200 mmol/L NaCl处理时下降最显著。

与0 h相比，酸枣幼苗叶在50、100、150 mmol/L NaCl处理144 h的IAA含量差异显著，降幅分别是20.60%、31.97%、6.32%，酸枣幼苗根在100、150、200 mmol/L NaCl处理144 h的IAA含量差异显著，降幅分别是15.07%、7.40%、8.5%。图4

图4 酸枣叶、根在NaCl处理下生长素含量随时间变化
Fig.4 Effect of NaCl treatment on IAA in leaves and roots of sour jujube seedlings

2.5不同浓度NaCl处理对酸枣幼苗叶，根IAA/ABA比值的影响

研究表明，与对照相比，同一时间酸枣叶，根在0、50、100、150、200 mmol/L NaCl处理下IAA/ABA的值均显著下降。

与0 h相比，同一浓度，酸枣叶在0、50、100、150、200 mmol/L NaCl处理在0到48 h的IAA/ABA值随时间变化呈显著降低趋势，酸枣叶在50、100、150、200 mmol/L NaCl处理在48到144 h时IAA/ABA的值随时间变化无显著变化；酸枣根在50、100、150、200 mmol/L NaCl处理在0到24 h时IAA/ABA的值随时间变化而呈显著降低趋势，酸枣根在50、100、150、200 mmol/L NaCl处理在24到144 h时IAA/ABA的值随时间变化无显著变化。图5

图5 酸枣叶、根IAA/ABA的值随时间变化
Fig.5 Effect of NaCl treatment on IAA/ABA in leaves and roots of sour jujube seedlings

2.6不同浓度NaCl处理对酸枣幼苗叶、根GA3/ABA比值的影响

研究表明，与对照相比，50、100、150、200 mmol/L NaCl处理相同时间，酸枣叶、根GA3/ABA的值均显著下降。

与0 h相比，酸枣叶在0 mmol/L NaCl处理，GA3/ABA值随处理时间的延长无显著变化，100、150、200 mmol/L NaCl处理在0到96 h时随着时间的增加GA3/ABA 的比值显著降低，50 mmol/L NaCl处理在0到24 h时随着时间的增加GA3/ABA 的比值显著降低。酸枣根在0、100、150，200 mmol/L NaCl处理下在0到24 h时随着时间的延长GA3/ABA 的比值显著降低。图6

图6 酸枣叶、根GA3/ABA的值随时间变化

3 讨 论

ABA在植物响应盐胁迫时有至关重要的作用。盐胁迫下，植物通过激活ABA的合成途径和抑制其降解途径使得植物体内ABA含量增加[16]，在NaCl胁迫下，高浓度盐胁迫后杨树内源激素ABA含量在短时间内迅速升高[17]；长叶红砂幼苗在NaCl浓度≥ 100 mmol/L时ABA含量随NaCl浓度的升高而逐渐升高[18]。研究发现，酸枣叶和根在同一浓度NaCl处理随时间的增加ABA含量显著增加；在同一处理时间100、150、200 mmol/L NaCl处理均显著升高，这可能是因为随着盐处理浓度的增大，ABA含量的上升促使氧自由基产生与清除之间能够维持动态平衡，从而降低了盐胁迫对细胞膜系统的氧化伤害同时在逆境下ABA含量升高可激活一系列抗性基因及蛋白的表达[19]，ABA 参与质膜 ATP 酶和液泡膜 ATP 酶的相关修饰过程，提高质子泵活性，为 Na+/ H+反向运输体提供了更多的驱动力，有效降低酸枣胞内 Na+的含量，同时增强 K+的选择性吸收，有益于维护细胞膜的稳定性，提高植物对盐分离子的耐受性是植物逆境自我保护的一种表现[20]。

GA3在缓解盐胁迫对种子萌发及植物生长方面也发挥了重要作用。温福平等[21]发现在盐胁迫条件下，GA3能提高粳稻日本晴(Oryza sativaL． cv． Nipponbare) 种子的发芽势，并可以显著的恢复盐胁迫下种苗根和芽的伸长生长，缓解盐胁迫对种子萌发的抑制作用。在300 mmol/L NaCl胁迫下，吴屯杨和荷兰杨在处理第15 d GA含量显著低于对照[22]，王鹏等[23]研究发现油葵 GA3的含量随着 NaCl浓度的增加表现为先升高后降低的趋势。於丽华等[24]研究发现，从不同 NaCl 浓度对甜菜叶片中GA3含量影响来看，GA3含量随着NaCl浓度的升高而降低。研究结果显示，酸枣在同一时间与对照相比50、100、150、200 mmol/L NaCl幼苗叶和根的赤霉素含量均显著下降并且随着NaCl处理浓度的增加下降越显著，这可能是由于在低浓度盐环境中酸枣幼苗随着盐浓度的升高增加了膜脂过氧化产物MDA，导致膜功能紊乱使得 GA3含量降低[25]。

在NaCl胁迫下草莓根系和叶ABA含量增加，IAA、GA和ZT含量减少[26]，Kuiper等[27]发现盐胁迫使得耐盐大麦品种根中ZT、ZR含量迅速下降，阳燕娟[28]的研究发现，盐胁迫下西瓜幼苗ZT含量明显减少。研究结果显示，在同一时间100、150、200 mmol/L NaCl处理幼苗叶中ZT含量均低于对照并且有显著差异，同一时间50 mmol/L NaCl处理幼苗叶中ZT含量显著高于对照，在144 h时显著低于对照，对照和50 mmol/L NaCl处理有上升趋势这可能是因为酸枣幼苗初期需要大量ZT来促进酸枣幼苗细胞分裂，而100、150、200 mmol/L NaCl幼苗叶和根随时间的增加都有降低的趋势，这可能是由于盐胁迫是通过降低SOD的活性，削弱清除自由基的能力，促进膜脂过氧化作用，导致膜脂过氧化产物(如MDA)积累。然后这些过氧化产物与一些细胞组分进行反应，使一些酶和膜(结构和功能)遭到破坏，导致质膜透性增大，胞内溶质外渗，外界盐离子进入，从而破坏胞内离子平衡，导致代谢紊乱，使得酸枣幼苗叶和根ZT含量降低[29]。

IAA 影响植物多种生理过程，但IAA与盐胁迫关系研究相对较少。Wang等[30]认为盐胁迫下IAA的运输通路在侧根系统的形成中发挥了重要作用，证明了IAA的转运活性决定了侧根的产生和伸长，形成适应盐胁迫的根系系统，增强植物对盐渍环境的耐受能力。对照和50 mmol/L NaCl碱茅幼苗叶中IAA含量也都呈上升趋势，但是200、400 mmol/L NaCl碱茅幼苗叶中IAA含量初期上升，后期下降[31]。盐处理的碱茅幼苗叶中IAA含量在处理初期虽然呈上升趋势，但都低于CK，并且随着盐胁迫浓度和时间的增加呈下降趋势[32]。研究发现同一时间与对照相比，NaCl处理幼苗叶和根中IAA含量均显著降低，同一浓度，与0 h相比50和100 mmol/L NaCl叶中IAA含量显著降低，这可能酸枣幼苗在NaCl处理下因为离子毒害打破了离子平衡，高浓度Na+通过 Na+/H+逆向转运蛋白介导根部细胞 Na+的外排和H+内向运输[33]，破坏了正常的胞外pH、环境，从而使 IAA 的运输受到很大的抑制。同一浓度，与0 h相比，50和100 mmol/L NaCl根中IAA含量初期先上升，后期下降，可能是由于当酸枣幼苗遭遇盐胁迫时，通过诱导非色氨酸途径中关键酶腈水解酶 NIT1 与 NIT2(nitrilase1/2)促进 IAA合成量的增加，使 IAA 的合成水平增加以供自身生长[34]，因此，处理初期IAA含量呈上升趋势，但是由于盐胁迫的影响，导致调节IAA氧化酶活性增加，加快了IAA的降解使得IAA含量降低[35]。

王琦等[36]研究发现 CO2浓度升高使植物中 IAA 含量升高，而降低 ABA含量故 IAA/ABA的比值会升高，而GA3的变化与IAA 总体一致，所以也提高了GA3/ABA 的比值，由于IAA 能够促进细胞伸长、分裂，而ABA会降低植物生长势，产生休眠。此比值降低能够增强抑制生长发育的作用，从而抑制植物生长。GA3的变化与 IAA 总体一致，由于GA3能够促进酸枣幼苗生长，因此，GA3/ABA 降低也能使植物进入休眠，不利于酸枣生长。研究发现随着NaCl处理浓度和时间的增加酸枣幼苗叶子有萎蔫的现象，同一时间，与对照相比，酸枣幼苗叶和根在50、100、150、200 mmol/L NaCl处理时的IAA/ABB、GA3/ABA的比值随时间变化显著降低，同一浓度，与0 h相比，酸枣幼苗叶和根在50、100、150、200 mmol/L NaCl处理144 h的IAA/ABB、GA3/ABA的比值显著降低，可见ABA与IAA、GA3存在着拮抗作用，由于盐浓度的增加导致ABA含量显著增加，而IAA、GA3含量也显著下降。

4 结 论

与对照相比，同一时间点下对应的各盐浓度处理24到144 h后，酸枣幼苗叶片和根的ABA含量均显著增加，并且同一时间点下盐处理浓度越大ABA含量增加越显著，同一时间点下对应的盐浓度处理6到144 h后，酸枣幼苗叶片和根的IAA/ABA、GA3/ABA比值、IAA、GA3含量，酸枣幼苗根的ZT含量均显著降低。

与0 h相比，在同一盐浓度处理下随着时间的推移，酸枣幼苗叶片和根的ABA含量显著增加，但增加的速度随着时间的推移趋于平缓，IAA/ABA、GA3/ABA的比值前期显著降低，中后期下降速度趋于平缓。

NaCl处理下， 酸枣幼苗通过增加叶和根ABA含量，降低IAA、ZT、GA3含量、IAA/ABA和GA3/ABA的比值来适应盐处理带来的影响。