奎宁功能化的混合模式有机-硅胶杂化整体柱的制备和应用

刘 凯， 郑 娜， 林旭聪， 吕海霞

(1. 福州大学材料科学与工程学院， 福建 福州 350116； 2. 福州大学化学学院， 福建 福州 350116)

0 引言

毛细管电色谱(CEC)是一种结合毛细管电泳(CE)和液相色谱(LC)双重分离性能的微分离技术， 是当前微分离分析技术的热点. 毛细管色谱柱是CEC的核心. 在色谱柱中毛细管整体柱由于制备简单， 通透性良好， 可实现快速分离， 具有较高的相比和柱容量[1-2].

在整体柱中有机-硅胶杂化整体柱在无机硅胶整体柱的基础上， 结合有机聚合整体柱的优点， 具有较好的机械稳定性、 抗溶胀性和耐酸碱性以及具有较大的比表面积等优点[3-5]， 得到分离领域的广泛关注. 随着功能化单体的发展， 发展新型功能化杂化整体柱在近年来备受关注， 比如混合模式整体柱.

混合模式色谱是指一根色谱柱上能够实现两种或多种分离机理共同主导的分离技术[6-8]， 利用固定相多种作用力对物质进行保留、 分离， 具有更好的选择性和分离效率. 近年来， 在含氯的硅胶整体柱上通过亲核反应衍生含氮杂环的化合物， 为制备混合模式杂化整体柱提供新的方向[9]， 反应生成的季铵型阳离子， 不仅可以提供阴离子作用位点， 还可以有效地削减整体柱上残留的硅羟基所造成的不利影响. Wang等[10]以4, 4′-联吡啶作为功能单体， 在氯丙基硅胶杂化整体柱上通过柱后衍生， 制备混合模式的杂化整体柱， 该整体柱具有亲水作用、 π-π作用、 阴离子交换作用以及氢键作用， 并且成功应用于CEC对苯酚类、 核苷酸类、 生物碱类等多类物质的分离. 目前氯丙基整体柱与含氮杂环的化合物主要集中在含吡啶类和咪唑类离子液型化合物， 在喹啉类化合物还未见报道.

通过柱后衍生， 将奎宁修饰到氯丙基硅胶基质柱上， 制备出新型的混合模式有机-硅胶杂化整体柱. 奎宁功能化的杂化硅胶整体柱具有明显的反相作用、 π-π作用和阴离子交换作用. 在CEC模式下， 整体柱对模版分子、 多环芳烃、 有机酸类物质以及碱性的烟碱类物质实现高效分离.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器： 毛细管电色谱仪(2 100 GV， Unimicro， USA)； 电子扫描显微镜(XL30ESEM， FEI， USA).

试剂： 四甲氧基硅烷(TMOS)、 氯丙基三甲氧基硅烷(CPTMS)、 尿素(Urea)和奎宁(Acros, New Jersey, USA)； 聚乙二醇(PEG， 10 000 M.W.， Aldrich, Milwaukee, WI, USA)； 醋酸(色谱纯， 天津福辰试剂)； 对羟基苯甲酸、 苯甲酸、 肉桂酸(Milwaukee, WI, USA)； 甲苯、 硫脲、 N, N-二甲基甲酰胺(DMF)、 磷酸、 盐酸、 氢氧化钠、 三乙胺(分析纯， 上海试剂总厂)； 萘、 芴、 菲、 芘(阿拉丁)； 尼古丁氧化物 (NC-1-oxide)、 可替宁(COT)、 3-羟基可替宁(3-OH-COT)、 可替宁氮氧化物(COT-N-oxide)、 降尼古丁(NNC)(98%， 中国药品与生物制品检定所)； 实验用水为二次蒸馏水.

毛细管柱(75 μm ID×375 μm OD， 河北永年光导纤维厂).

1.2 毛细管整体柱的制备

图1 奎宁功能化的杂化整体柱制备示意图Fig.1 Scheme for the preparation quinine of functionalized hybrid monolithic column

1) CP-硅胶柱的制备. 首先将680 mg PEG和900 mg Urea溶解于5.0 mL 0.01 mol·L-1醋酸水溶中， 再将0.6 mL CPTMS和1.8 mL TMOS加入， 在冰浴条件下搅拌水解4 h. 形成透明均一的溶胶溶液后， 取1 mL水解液， 冰浴超声3 min， 用微型注射器注入预处理好的毛细管中. 将毛细管两端封闭， 置于55 ℃恒温水浴锅中反应12 h， 反应结束后用二次水和甲醇依次冲洗柱子， 除去未反应的制孔剂和其它残留的物质， 得到氯丙基功能化的杂化整体柱.

2) 奎宁衍生修饰CP-硅胶柱. 将含有40 mg·mL-1的奎宁和KI催化剂的甲醇/水(3∶1， 体积比)溶液通过液相色谱泵注入到已制备好的CP-硅胶整体柱中， 在80 ℃下反应12 h. 最后用二次水和甲醇依次清洗， 将柱床内残留的反应物洗出， 即得到奎宁修饰的CP-硅胶杂化整体柱. 反应原理如图1所示.

1.3 色谱条件

实验所用流动相为乙腈-磷酸三乙胺(TEAP)缓冲液. 流动相使用前用0.22 μm微膜过滤， 超声脱气. 实验前整体柱用甲醇平衡30 min， 在电色谱仪器上施加电压平衡至所获得稳定的电压和基线信号. 柱温保持室温.

2 结果与讨论

2.1 奎宁衍生条件优化

由于奎宁分子结构中的N原子与CP-硅胶柱固定相表面的氯丙基发生亲核反应， 产生季铵型阳离子， 从而可以提供反向电渗流. 所以实验通过分析奎宁功能化的杂化整体柱产生EOF的情况来优化奎宁的反应浓度.

图2 奎宁浓度对EOF的影响Fig.2 Effect of quinine concentration on EOF

在乙腈∶磷酸三乙胺(5 mmol·L-1, pH=3.0)=45∶55(体积比)， 分离电压为+20 kV的条件下， 实验考察奎宁的浓度在10～50 mg·mL-1间EOF的变化， 如图2所示. 奎宁功能化的杂化整体柱在酸性条件下产生反向电渗流， 说明奎宁成功衍生在氯丙基硅胶基质柱上. 在10～40 mg·mL-1之间时， 随着奎宁浓度的增大， 电渗流急剧增大， 当奎宁的浓度从40增加到50 mg·mL-1时， 曲线上升趋势不明显， EOF接近定值. 因此， 当奎宁在缓冲液中的浓度为40 mg·mL-1时， 整体柱具有明显的电渗流， 所以40 mg·mL-1为奎宁的的衍生浓度.

2.2 整体柱特征分析

2.2.1 形态分析

利用扫描电镜(SEM)对奎宁衍生制备的杂化整体柱的形貌特征进行观察， 如图3所示. 该杂化整体柱的固定相呈球团态， 固定相与毛细管内壁紧密键合， 没有脱壁现象； 柱床结构均匀， 既有大孔径的中孔， 又有微孔径的通孔， 有利于分析物与杂化柱的相互作用.

图3 奎宁功能化杂化整体柱的电镜图Fig.3 SEM images of quinine functionalized hybrid monolithic capillary columns

2.2.2 EOF

图4 pH值对奎宁杂化整体柱和氯丙基硅胶柱EOF的影响Fig.4 Effect of pH on the EOF of hybrid monolithic column and quinine-silica monolithic column

由于季铵型阳离子的生成， 整体柱可以产生反向EOF； 奎宁分子上有残留的硅羟基， 可以电离带负电. 所以固定相表面净电荷的密度决定EOF的大小. 在乙腈∶磷酸三乙胺(5 mmol·L-1)=45∶55(体积比)， 分离电压为+20 kV的条件下， 实验研究流动相pH值对EOF大小的影响， 如图4所示. 在较低的pH值(3.0～6.0)范围内， 随着pH值的增大， EOF值逐渐减小， 这是因为奎宁分子上的硅羟基开始解离， 带负电的硅羟基使固定相表面正电净电荷减小， 导致整体柱的EOF减小. 继续增大流动相的pH值， 奎宁分子大量解离的硅羟基， 抑制了N原子的质子化， 致使EOF由阳极EOF转变为阴极EOF. 这与文献报道的在CP-硅胶基质柱上修饰含氮杂环化合物产生EOF变化情况相似[11].

2.2.3 整体柱分离的重现性

实验选用硫脲作为不保留物质， 通过考察整体柱的EOF、 甲苯、 DMF、 甲酰胺的保留时间和柱效来评价整体柱的重现性. 实验计算获得整体柱的EOF， 结果显示整体柱在日内(n=5)、 日间(n=3)以及不同批次间的RSD≦3.0%， 保留时间和柱效RSD保持在4.6%(n=5或n=3)以内， 这表明通过奎宁衍生制备的杂化整体柱重现性良好.

2.3 电色谱性能表征

2.3.1 极性小分子的分离

实验首先选择甲苯、 DMF和硫脲3种极性小分子来考察杂化整体柱的色谱保留作用. 3种分子的电色谱分离图， 如图5所示， 出峰顺序为硫脲、 DMF、 甲苯. 在保证磷酸三乙胺为5 mmol·L-1, pH值为 3.0， 分离电压+20 kV不变的条件下， 考察乙腈含量对模板分子保留的影响， 如图6所示， 当流动相中ACN含量(体积分数， 下同)低于78%时， 极性最强的硫脲先出峰， 极性强的DMF次出峰， 极性稍弱的甲苯最后出峰， 根据极性从强到弱的方式， 与反相作用保留模式保持一致. 继续增加ACN含量， 杂化柱对非极性物质甲苯洗脱作用加强， 在78%～90%之间， 甲苯和DMF的出峰顺序发生变化， 当ACN含量高于90%时， 出峰顺序变为甲苯、 硫脲、 DMF， 说明奎宁修饰的杂化整体柱具有弱的亲水作用.

图5 3种极性小分子的电色谱分离图Fig.5 Electromatoram of three small polar molecules

图6 乙腈对极性小分子保留因子的影响Fig.6 Effect of ACN on the retention factors of small polar molecules

2.3.2 多环芳烃的分离

实验考察所制备的整体柱对多环芳烃(PAHs)类化合物的分离能力. 实验选用4种多环芳烃类物质萘、 芴、 菲、 芘， 其不饱和度依次为7、 8、 10、 12， 如图7所示， 4种物质在奎宁功能化的杂化整体柱上实现了基线分离， 萘、 芴、 菲、 芘依次出峰， 按照四种物质的不饱和度即π共轭体系增大的顺序出峰， 因为奎宁分子中含有较强的π共轭结构， 与4种多环芳烃产生π-π作用， 所以奎宁功能化的杂化整体柱与多环芳烃之间的保留作用基于π-π作用. 实验在磷酸三乙胺为5 mmol·L-1, pH值为3.0， 分离电压+20 kV不变的条件下， 考察乙腈含量对多环芳烃保留因子的影响， 如图8所示， 乙腈含量在40%～60%之间， 随着乙腈含量的增加， 4种多环芳烃的保留因子逐渐减小， 这是由于乙腈含量提高， 增强了对4种多环芳烃的洗脱， 反相作用减弱. 综上， 表明固定相对多环芳烃的保留作用主要是π-π作用和反相作用. 图7为乙腈含量50%时四种多环芳烃分离的色谱图.

图7 PAHs的电色谱分离图Fig.7 Electrochromatogram of PAHs

图8 乙腈含量对PAHs保留因子的影响Fig.8 Effect of ACN on the retention factors of PAHs

2.3.3 有机酸的分离

实验考察了所制备的整体柱对苯甲酸类化合物(对羟基苯甲酸、 苯甲酸、 肉桂酸)的分离. 由于奎宁与氯丙基发生亲核反应生成季铵型阳离子， 提供阴离子交换作用的位点， 在较低的酸性条件下， 该杂化柱主要提供反向电渗流. 因此实验在乙腈∶磷酸三乙胺(5 mmol·L-1)=45∶55(体积比)， 分离电压为+20 kV的条件下， 通过改变pH值来考察3种苯甲酸类物的保留. 如图9所示， 在pH值3.0～4.0范围内， 随着pH值的增大， 3种有机酸的电离程度增强， 与杂化整体柱固定相之间的静电吸附作用增强， 故有机酸保留作用增强. 继续增大pH值， 苯甲酸和肉桂酸的保留因子开始减小， 这是因为随着pH值的增大， 奎宁分子上的硅羟基解离使整体柱固定相表面所带净正电荷减小， 导致3种有机酸与固定相间的静电吸附作用减弱. 这一结果与离子交换作用机理相一致[12].

2.3.4 烟碱类化合物的分离

在毛细管电色谱模式下， 利用无机硅胶柱或通过sol-gel法制备的有机-硅胶杂化整体柱对碱性化合物的分离时， 由于毛细管柱壁有残留的硅羟基， 在分离时会产生非特异性吸附， 导致峰形拖尾， 分离效果不理想. 针对此类问题， 实验选用5种烟碱类碱性化合物(尼古丁氧化物、 可替宁、 3-羟基可替宁、 可替宁氮氧化物、 降尼古丁)， 利用混合模式进行分离. 由于烟碱类化合物均带有共轭的氮杂环结构可与杂化柱产生疏水作用和π-π作用， 而且在酸性条件下电离带正电， 烟碱类化合物可与杂化柱产生静电作用. 结果如图10所示， 在乙腈∶磷酸三乙胺(5 mmol·L-1, pH=3.0)=40∶60(体积比)， 分离电压为+15 kV的条件下， 5种烟碱类化合物在CEC模式下按照极性由强到弱的顺序出峰， 实现了良好的分离， 峰形基本对称， 没有明显的拖尾情况.

图9 pH值对3种有机酸的保留因子影响Fig.9 Effect of pH on the retention factors of three organic acids

图10 5种烟碱化合物的电色谱分离图Fig.10 Electrochromatogram of five nicotinic compounds

3 结语

在氯丙基硅胶整体柱固定相表面， 通过亲核反应衍生奎宁功能单体， 制备新型混合作用模式的有机-硅胶杂化整体柱. 该杂化整体柱结构均匀， 而且由于奎宁功能单体的引入， 使得该杂化整体柱在低pH值条件下产生阳极EOF， 可以提供阴离子交换作用， 同时具有疏水作用和π-π作用. 极性小分子、 多环芳烃以及有机酸在杂化整体柱上得到基线分离， 并且在混合模式下实现了对烟碱类物质的分离， 没有明显拖尾现象.

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