还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶染色法术中快速诊断婴幼儿先天性巨结肠的价值

赵淑君，李鸿岩，阿米娜·哈山

(乌鲁木齐市第一人民医院病理科，新疆 乌鲁木齐 830011)

先天性巨结肠(Hirschsprung′s disease，HD)是由于胚胎期神经嵴细胞干细胞在移行过程中发生中断导致远端肠管神经节细胞缺如而引起的一种先天性消化道畸形[1]，其临床症状主要是胎便排出延迟、腹胀及肠梗阻等。目前，HD的主要治疗方法是手术切除病变肠管，由于手术方法的不断改进及微创化，适合手术的患者年龄也不断提前，婴幼儿手术越来越常见[2-3]。HD手术成功与否在于能否最大限度地保留正常肠管并完整切除病变肠管，这需要依赖术中快速冰冻苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色进行诊断，但由于在冰冻切片过程中易产生冰晶及裂隙，导致辨识神经节细胞及神经节细胞计数存在一定的困难，因此，需要建立一个快速、精准且易操作的术中快速病理诊断方法。本研究使用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(nicotinamide adenine dinuleotide phosphate diaphorase，NADPH-d)酶组织化学染色法用于HD术中快速病理诊断，并与术中快速冰冻HE染色法进行对比，以分析NADPH-d酶组织化学染色法在HD术中快速病理诊断中的价值，为建立快速、准确的HD术中快速诊断方法提供新的选择。

1 资料与方法

1.1一般资料收集2015年1月至2017 年3月新疆乌鲁木齐儿童医院收治的37例HD患儿的术中切除肠管作为观察对象，所有病例术后经常规病理检查确诊为HD，其中男29例，女8例，年龄 3 d 至3个月，中位年龄为2个月；每例患儿的肠管分扩张段、痉挛段取材，置于低温冰箱冷冻保存。另外取5例因坏死性小肠结肠炎行结肠造瘘术患儿的切除肠管标本作为实验对照，其中男3例，女2例，年龄1～3个月。结肠造瘘术患儿术后病理检查确定肠壁肌间和黏膜下神经丛内神经节细胞发育正常。研究所用标本均取自手术中切除肠管，并经医院伦理委员会批准。

1.2主要试剂与仪器NADPH-d、氮蓝四唑(nitro-blue tetrazolium，NBT)购自美国Sigma公司，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)、Triton x-100购自北京索莱宝公司，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购自美国MP Biomedicals公司，二甲苯购自天津市致远化学试剂有限公司，303-0型台式培养箱购自北京市永光明医疗仪器厂。

1.3标本切片及分组对HD患儿的肠管扩张段、痉挛段标本进行常规冰冻连续切片，片厚4～5 μm，用普通载玻片贴片，奇数切片进行NADPH-d酶组织化学染色(NADPH-d染色组)，偶数切片进行冰冻切片HE染色(HE染色组)。同时将结肠造瘘患儿的切除肠管标本进行常规冰冻连续切片，片厚4～5 μm，用普通载玻片贴片，待NADPH-d染色组标本切片进行NADPH-d酶组织化学染色观察时，将奇数切片做实验阳性对照，偶数切片做实验阴性对照。

1.4NADPH-d酶组织化学染色观察神经节细胞NADPH-d染色反应液组成：1 mL 0.1 mol·L-1PBS(pH 8.0)中加入NADPH-d 0.5 mg、NBT 0.6 mg、二甲基亚砜10 μL、Triton x-100 3 μL。NADPH-d染色组标本切片和实验阳性对照切片滴加上述反应液约100 μL，置于孵育盒内放入37 ℃培养箱中，8～10 min后先取出实验阳性对照切片，在显微镜下观察神经节细胞显示清晰后，将NADPH-d染色组标本切片全部取出，用PBS冲洗终止反应，并用水性封片剂封片，在显微镜下观察神经丛及神经节细胞的染色情况。为判断神经丛所在位置及与冰冻切片HE染色结果进行对比，NADPH-d染色组标本切片进行NADPH-d 酶组织化学染色并在显微镜下观察神经丛及神经节细胞的染色情况、采集图像后，再进行冰冻切片HE染色复染，然后再次采集图像，存档后观察分析。实验阴性对照切片用NADPH-d酶组织化学染色方法染色，其反应液组成：NBT 0.6 mg、二甲基亚砜10 μL、Triton x-100 3 μL。此反应液中不加入NADPH-d，其他实验条件及步骤同NADPH-d染色组，以排除其他因素对实验的影响。

1.5快速冰冻HE染色观察神经节细胞HD患儿HE染色组标本冰冻切片置于室温下干燥 2～3 min，用体积分数95%乙醇固定4～5 min，自来水清洗2 min，苏木精染色3～4 min，自来水清洗 2 min，伊红染色20～30 s，体积分数70%、85%、95%、95%、100%、100%梯度乙醇各放置30 s，二甲苯Ⅰ及二甲苯Ⅱ各放置5～8 min使切片组织透明，中性树胶封片后显微镜下观察神经节细胞。

1.6判定标准(1)NADPH-d染色：HD患儿NADPH-d染色组扩张段标本及实验阳性对照标本，在低倍镜下肠壁肌间可见丰富的蓝紫色神经丛呈串珠状分布，高倍镜下神经丛内可见蓝紫色神经节细胞，其细胞体积大，细胞核空白无着色，细胞质呈蓝紫色；NADPH-d染色组痉挛段和实验阴性对照标本切片神经丛无着色；(2)HE染色：HD患儿HE染色组扩张段标本低倍镜下见肌间及黏膜下神经丛，神经节细胞隐约可见，高倍镜下神经丛内可见体积较大的神经节细胞，其细胞质丰富，核清晰可见，核内可见明显核仁；HD患儿HE染色组痉挛段神经丛内不出现神经节细胞。

1.7统计学处理应用SPSS 13.0软件进行统计学处理，2种不同染色组诊断结果组间比较采用配对χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1NADPH-d染色组和HE染色组诊断结果比较结果见表1。37例患儿中，NADPH-d染色诊断阳性36例(97.3%)，阴性1例(2.7%)；HE染色诊断阳性34例(91.9%)，阴性3例(8.1%)；2种染色方法均诊断阳性或阴性者分别为34例、1例，另2例NADPH-d染色诊断阳性者HE染色诊断为阴性；2种染色方法的诊断结果比较差异无统计学意义(χ2=0.059，P>0.05)。

表1HD患儿肠管标本NADPH-d酶组织化学染色与HE染色诊断结果比较

Tab.1ComparisonofdiagnosticresultofNADPH-dandHEstainingtechnique

NADPH⁃d染色组HE染色组+-合计+34236-011合计34337

2.2NADPH-d染色组染色情况NADPH-d染色组扩张段标本低倍镜下观察可见呈串珠状分布的神经丛样结构(图1A)，高倍镜下可见细胞质着紫蓝色、细胞核空白无着色的细胞(图1B)；NADPH-d酶组织化学染色后进行HE复染显示原先串珠状分布的紫蓝色组织为肌间神经丛(图1C)，黏膜下未见着紫蓝色的神经丛；高倍镜下可清楚分辨核大、深染、细胞质略呈蓝色的神经节细胞(图1D) 。NADPH-d染色组痉挛段镜下见背景清晰，无任何着色，未见神经丛及神经节细胞(图1E)。实验阳性对照染色结果同扩张段(图1F)，实验阴性对照不着色(图1G)。

A：NADPH-d染色组扩张段，神经丛呈串珠状分布(×100)；B：NADPH-d染色组扩张段，神经节细胞质显紫色，细胞核空白无着色(×200)；C：NADPH-d染色组扩张段HE复染，可见串珠状分布的紫蓝色肌间神经丛(×100)；D：NADPH-d染色组扩张段HE复染，可见核大、深染的神经节细胞(×200)；E：NADPH-d染色组痉挛段，背景清晰，未见神经节细胞(×100)；F：实验阳性对照标本(×100)；G：实验阴性对照标本(×100)。

图1结肠组织NADPH-d染色

Fig.1NADPH-dstainingofcolonictissue

2.3HE染色组染色情况HE染色组扩张段标本肌间神经丛内隐约可见神经节细胞 (图2A、B)；HE染色组痉挛段肌间及黏膜下可见分布杂乱的神经丛，其间无神经节细胞(图2C、D)。

A：HE染色组扩张段，可见神经丛(×100)；B：HE染色组扩张段，隐约可见神经节细胞(×200)；C：HE染色组痉挛段，可见神经丛结构(×100)；D：HE染色组痉挛段，神经丛内未见神经节细胞(×200)。

图2结肠组织HE染色

Fig.2HEstainingofcolonictissue

3 讨论

先天性巨结肠是一种多基因遗传病[4]，HD是婴幼儿常见且严重的消化道畸形之一，全球发病率约为1/5 000，其中亚洲人种发病率较高，为1/3 000～1/2 000，仅次于先天性肛门闭锁，居第2位[5-6]。20%的患儿在新生儿期因肠梗阻就诊[4]，但大部分HD患儿就诊较晚，且因病变导致生长发育滞后[7]。目前，大多数国内外学者把3个月以内手术者称为巨结肠的早期治疗[7-8]。胚胎时期肠神经系统异常发育导致神经节细胞在远端肠管的异常或缺如被认为是HD发病的主要原因[9]。HD的诊断依据是远端病变肠壁肌间与黏膜下层神经节细胞缺如，手术切除病变肠管是唯一疗效确切的根治方法。由于在神经嵴细胞发育的过程中，受多种因素的影响，神经节细胞可能发育不成熟甚至完全未发育[10-11]，对于婴幼儿，这种发育不成熟的神经节细胞更常见，在术中冰冻切片HE染色中不易观察，直接影响诊断准确率。另外，术中快速冰冻HE染色受病理科医师主观判断的影响较大，有些病例对于经验不足的病理医生更是难以判定，这不仅延长手术时间，也导致肠管切除不充分或过长，对新生儿及小婴幼儿的不利影响会明显增加。国外学者MAIA[12]报道，术中快速冰冻HE染色诊断HD与常规病理检查的符合率约为89%，这会影响一部分患儿的预后。

NADPH-d能准确标记一氧化氮合酶，此酶释放内源性一氧化氮，后者可通过肠神经系统使肠管扩张。近年来，许多学者以NADPH-d酶组织化学染色法研究HD有无神经节细胞肠管中一氧化氮合酶的分布，发现该方法可对HD进行快速诊断，尤其是对新生儿期HD[13-14]。本研究采用NADPH-d酶组织化学染色法对37例婴幼儿HD患儿的肠管标本进行染色，发现36例HD扩张段肠壁肌间神经丛内可见清晰的细胞质呈紫蓝色、细胞核空白的细胞；为证实染色细胞的准确性，对组织进行HE复染，证实该细胞为神经节细胞；而痉挛段肠壁神经丛中均缺乏阳性表达，镜下背景清晰，无任何着色，未见神经丛及阳性神经节细胞，与扩张段形成强烈反差，进一步证实痉挛段是由于缺乏一氧化氮合酶使肠管无法扩张而引起痉挛。本研究还发现，扩张段黏膜下未见阳性神经丛，与其他研究结果一致[13-14]，其原因有待进一步研究。本研究结果显示，NADPH-d组与HE染色组均诊断阴性为1例，均诊断阳性为34例，2种染色方法的阳性率比较差异无统计学意义，但NADPH-d染色试验时间仅为 8～10 min，而HE染色试验需30 min，因此，本研究提示，NADPH-d酶组织化学染色法适用于术中快速诊断婴幼儿HD，其最大优势在于诊断时间短且阳性结果易识别，结合术中快速HE染色法可以提高HD的诊断准确率，帮助确定病变肠管的切除范围。

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