产抗菌肽芽孢杆菌的制剂制备及其对仔猪生产性能的影响

曹 丁，黄乐天，李学优，黄魁英，张宜靖，夏枫耿

（广州市微生物研究所，广东广州510663）

抗菌肽又称抗微生物肽，是指广泛存在于生物体内，能抵抗外界病原菌侵害，具有多种免疫活性的先天性防御小分子多肽类物质（Nakatsuji等，2012）。抗菌肽分子质量小，水溶性好，热稳定性高，天然无免疫原性，且抗菌谱广，还具有抗肿瘤病毒和免疫调节活性（Ganz，2003）。此外，抗菌肽不易产生耐药性，可有效解决抗生素滥用导致的耐药性菌株增加和禽畜产品中出现抗生素残留等问题（Cao 等，2010）。

多种动物致病菌有良好的杀菌效果，且对阴性致病菌的效果优于阳性致病菌。与基因工程类或天然抗菌肽相比，表达稳定，且可耐受115℃高温，对酸碱和蛋白酶耐受性较好，可到达肠道发挥作用而不失活。

在抗菌肽制剂制备方面，与真空冷冻干燥技术相比，喷雾干燥方法具有干燥能耗较少、生产效率较高、成本低、可连续进料等优点 （付博等，2012），适合工业大规模生产，且所得粉末制剂含水量低，可以长期稳定保存（Gardiner等，2000）。因此，本研究对有一定热稳定性的产抗菌肽的枯草芽孢杆菌发酵液进行喷雾干燥处理，制成高活性、易于运输贮存的粉末制剂。抗菌肽喷雾粉最重要的技术指标是杀菌效价，而制剂水分含量则是决定其储存期长短的重要因素。本研究运用压力喷雾干燥机，对经微囊化的枯草芽孢杆菌发酵液进行干燥处理，并对喷雾干燥过程中的主要影响因素如吸附剂（保护剂）的种类、吸附剂的浓度、喷雾的出风温度和进风温度进行了优化，确定其最佳喷雾干燥工艺条件，以提高产品得率、减少损失，同时获得性能稳定、易于运输和保存的粉末制剂产品，并对抗菌肽粉末制剂作为饲料添加剂应用于仔猪养殖的效果进行了验证。

1 材料与方法

1.1 供试菌 产抗菌肽的枯草芽孢杆菌GL08和大肠杆菌K12D31由广东省微生物种质资源库保存。

1.2 主要试剂及培养基 种子培养基：葡萄糖20 g/L，酵母抽提物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，pH=7.0，固体培养基加20 g/L的琼脂粉。发酵培养基：葡萄糖 30 g/L，蔗糖20 g/L，国产酵母膏30 g/L，黄豆饼粉10 g/L，氯化钠1 g/L，磷酸二氢钾0.8 g/L，七水合硫酸镁0.2 g/L，碳酸钙4 g/L，pH=6.7。效价检测用培养基：氯化钠 10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母抽提物5 g/L，葡萄糖5 g/L，琼脂粉 20 g/L，pH=7.0。

酵母抽提物，胰蛋白胨：英国 Oxoid公司；琼脂粉：广州环凯生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器设备 生化培养箱，DHZ-DA大容量全温振荡器，752N型紫外可见分光光度计，50、500、5000 L不锈钢发酵罐，压力喷雾干燥机，显微镜，电子天平，pH计等。

1.4 GL08菌株喷雾发酵液的制备 将斜面保存的GL08菌株接种于种子培养基中，30℃、150 r/min培养24 h，然后以1%的接种量接种于50 L发酵罐中，并经过500、5000 L发酵逐级扩大培养，至稳定期后期结束培养，培养过程分别取样检测各种生理指标。

1.5 GL08菌株发酵液的喷雾干燥 将一定比例的保护剂加入待干燥的枯草芽孢杆菌GL08菌株发酵液中，用搅拌罐充分搅拌混匀，待保护剂溶解完全，可进行喷雾干燥。喷雾过程料液保持低速搅拌，保证粉末质量均一。

采用压力喷雾干燥塔，进风流量保持在40000 m3/h，高压泵压力为10～15 MPa。首先设置喷雾干燥器的进风温度，然后开机预热，当塔内进口温度达到设定温度时，开启高压泵和喷枪，将料液以一定的流速泵入喷雾塔中，以此来控制出风温度。干粉储存于旋风分离器下收集袋中，将干粉收集密封于室温干燥阴凉处保存。

1.6 喷雾干燥工艺的优化

1.6.1 喷雾干燥保护剂的选择 采用同一批发酵液作为喷雾料液，选择麦芽糊精、玉米淀粉、辅美粉作为吸附剂和载体进行喷雾干燥处理，控制喷雾的出风温度为75℃，试验中各载体添加量均为20%浓度，考察不同载体对抗菌肽喷雾干燥的保护作用。

1.6.2 载体添加量对喷雾干燥的影响 采用同一批发酵液作为喷雾料液，控制喷雾的出风温度为75℃，用辅美粉作为载体，添加量分别为5%、10%、15%、20%、25%进行发酵液的喷雾干燥试验，取样检测喷雾粉的杀菌效价和水分含量，比较不同载体添加量对抗菌肽喷雾干燥的影响。

1.6.3 进风温度对喷雾干燥的影响 采用同一批发酵液作为喷雾料液，控制一定的进料流量，分 别 选 择 进 风 温 度 为 130、135、140、145、150、155℃，选用20%的辅美粉载体添加量，进行发酵液的喷雾干燥试验，取样检测喷雾粉的杀菌效价和水分含量，比较不同进风温度对抗菌肽喷雾干燥的影响。

1.6.4 出风温度对喷雾干燥的影响 采用同一批发酵液作为喷雾料液，调节进风温度为135℃，选用20%的辅美粉载体添加量，分别选择不同的出风温度为 60、65、70、75、80、85 ℃， 进行发酵液的喷雾干燥试验，取样检测喷雾粉的杀菌效价和水分含量，比较不同出风温度对抗菌肽喷雾干燥的影响。

1.6.5 最佳喷雾工艺参数的正交试验 通过单因素试验考察保护剂种类和添加量、进风温度、出风温度对抗菌肽喷雾干燥过程中杀菌效价和水分含量的影响，然后采用三因素三水平正交表试验设计，以抗菌肽喷雾粉的杀菌效价和水分含量为指标，通过正交试验确定不同喷雾工艺参数的最佳组合。正交试验因素与水平见表1。

表1 正交试验的因素水平表

1.7 抗菌肽制剂质量测定

1.7.1 杀菌效价测定 称取1 g粉末溶解于9 mL pH 6.0的PBS缓冲液中，离心取上清，采用标准琼脂孔穴扩散法，参照梁洁等（2009）的方法。

1.7.2 水分含量测定 精确称量1～3 g抗菌肽粉末制剂，放入卤素水分测定仪中，记录测量结果。

1.7.3 抗菌肽得率 计算公式如下：

抗菌肽得率/%=（干燥后每克粉末制剂杀菌效价×制剂总重量）/（干燥前发酵液每毫升杀菌效价×发酵液总体积）×100。

1.8 仔猪的生产性能测定 随机选取60头30日龄仔猪，大白×大长×杜络克三元杂交猪，平均重约10 kg，从中挑选20头体型外貌较差的作为弱仔组，其他40头随机分为两组，分别为对照组和试验组，其中对照组饲喂基础日粮，试验组饲喂含0.01%效价为10万IU／g抗菌肽制剂的基础日粮，弱仔组饲喂含0.02%的抗菌肽制剂的基础日粮，对照组和试验组随机分栏，每栏10头，弱仔组单栏饲养，试验期30 d，试验开始前，对猪舍进行彻底清洁消毒，仔猪自由采食饮水，按猪场常规饲养管理方式进行。每天记录各组进食量，测定每头猪的初始体重，结束体重，计算个体平均日增重和平均日采食量，并记录观察仔猪在试验期的健康状况。

1.9 数据分析 数据处理采用SPSS 17.0统计分析软件处理，并采用T检验进行显著性分析，表中数据均用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 保护剂的筛选 由表2可知，选用不同载体，抗菌肽的得率均在90%以上。选用麦芽糊精作为载体时抗菌肽得率最高，但是其喷雾粉的含水量也偏高，这可能因为麦芽糊精极易吸水。麦芽糊精、水溶淀粉、辅美粉三种物料均可以作为抗菌肽的喷雾载体和吸附剂，但麦芽糊精和玉米淀粉属于多糖类物质，易吸水，水溶液比较黏稠，喷雾粉易贴壁，不易回收，而辅美粉价格较低，在保证产品得率的同时粉末含水量低，故后续试验以辅美粉作为喷雾载体。

表2 不同载体对喷雾干燥效果的影响 %

2.2 保护剂添加量对喷雾干燥的影响 保护剂在抗菌肽的喷雾干燥过程中，既可以作为吸附剂载体分散抗菌肽成分，又可以减少抗菌肽的高温损失。从表3可看出，保护剂浓度越高，抗菌肽得率越高，损失越少，但载体浓度太高时，抗菌肽的效价均偏低，而且高压泵的压力会增高，会引起细胞内蛋白变性，而降低回收率，也会增加生产工作量和设备负担。抗菌肽水分含量则随着保护剂浓度的增加呈现先降低后升高的趋势，水分含量高不利于保存的稳定性，根据喷雾粉质量要求，抗菌肽发酵液选用20%载体添加量最合适。

表3 载体添加量对喷雾干燥效果的影响%

2.3 进风温度对喷雾干燥的影响 从表4可看出，进风温度越高，抗菌肽的得率和水分含量越低。当进料流量确定时，进风温度越高，出风温度越高，共同影响着抗菌肽的得率和含水量。进料流量提高，出风温度相应降低，但进料流量过大，会导致喷雾粉含水量增多，粉尘分散性差粒径增大，极易贴壁，抗菌肽得率和保存稳定性降低。综合考虑，选择进风温度为135℃，此时抗菌肽的得率和含水量满足制剂质量要求。

表4 不同进风温度对喷雾干燥效果的影响

2.4 出风温度对喷雾干燥的影响 喷雾干燥是将料液雾化成液滴后与热空气充分接触在瞬间蒸发掉大部分水分。由于干燥时间极短大量水分蒸发吸热使得粉粒温度在极短时间内急剧下降，若出风温度过高说明水分蒸发后粉粒的温度仍处于高位，不利于细胞存活。而出风温度是由进风温度和进料流量决定的。从表5可看出，出风温度越高，抗菌肽的得率和含水量越低，当出风温度高于80℃时抗菌肽的得率明显降低。出风温度控制在75℃以下时产品活性损失较少。当出风温度低于65℃时，喷雾粉的含水量偏高，单位时间内的生产量较低，制备的抗菌肽制剂储存期短，因此选用出风温度为75℃。

表5 不同出风温度对喷雾干燥效果的影响

2.5 喷雾干燥最佳工艺确定 从表6可知，出风温度、进风温度、保护剂浓度对抗菌肽制剂的效价和含水量影响情况的显著性排序是相同的，均为出风温度＞进风温度＞保护剂含量。抗菌肽得率的最佳组合为A1B1C1，含水量的最佳组合为A3B3C2，考虑到出风温度和进风温度对抗菌肽得率的影响更显著，且抗菌肽得率这个指标更重要，因此选择A2B2水平。保护剂含量对两个指标的影响不显著，保护剂浓度过高时，会加重设备负荷和高压泵压力，过低时抗菌肽得率降低，因此选择C2水平。因此，本试验选择的最优组合为A2B2C2，即出风温度为75℃，进风温度为135℃，保护剂浓度为20%，在此水平下，进行3批次的喷雾干燥试验，抗菌肽得率的平均值为91.6%，含水量为3.94%，达到抗菌肽制剂的质量要求。

2.6 抗菌肽制剂对仔猪生产性能的影响 从表7可看出，在试验期间，添加抗菌肽制剂的试验组与无添加对照组相比，日增重提高35.2%，料肉比降低25%，弱仔组的日增重虽然没有明显提高，但料肉比下降15.3%；试验组仔猪在试验期间，无腹泻发生，残次率降低63%，成活率提高8.3%，弱仔组残次率与对照组相比，降低2%，但腹泻和死亡情况并无改善。以上数据说明抗菌制剂可在饲料中不添加抗生素的前提下，提高断奶仔猪的成活率，改善猪只肠道健康，降低料肉比和残次发生率，减少仔猪腹泻。

表6 抗菌肽制剂喷雾干燥的正交试验结果

表7 抗菌肽饲料添加剂对仔猪生产性能的影响

3 结论与讨论

本研究利用辅美粉作为保护剂，通过一系列优化试验，运用压力喷雾干燥塔对产抗菌肽的枯草芽孢杆菌发酵液进行了喷雾干燥最佳工艺的研究，发现出风温度对抗菌肽效价有着显著的影响，出风温度主要由进风温度和进料流量决定 （黄乐天等，2014）。当出风温度高于80℃时，抗菌肽效价明显降低。最终得到一组最佳喷雾干燥工艺：出风温度为75℃，进风温度为135℃，保护剂辅美粉浓度为20%，在此工艺条件下，抗菌肽得率的平均值为91.6%，含水量为3.94%，符合抗菌肽制剂质量要求。此工艺生产成本低，效率高，适合工业大规模生产。

枯草芽孢杆菌已广泛应用于饲用微生态制剂的生产中，其在改善畜禽生产性能、维持肠道菌群平衡及提高消化率等方面均有较好的效果（李明华等，2014）。研究表明，单一微生态制剂存在着作用单一，质量不稳定，成本高，杀菌效果不如抗生素等缺陷（田木，2015），本研究枯草芽孢杆菌能产生多种抗菌成分，尤其是抗革兰氏阴性菌效果显著。将枯草芽孢杆菌菌体和其代谢产物混合喷雾，在抗菌的同时也起到了调节肠道微生态平衡等作用。将所得的制剂作为饲料添加剂应用于仔猪养殖试验，可提高仔猪的生长性能，降低腹泻，提高其健康水平。本研究所得的抗菌肽枯草芽孢杆菌制剂可作为饲料添加剂应用于动物养殖中，更多的动物养殖应用效果试验有待进一步开展。

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