急性缺血性脑卒中患者血清闭锁蛋白1、4的动态变化及其与肠黏膜屏障功能的关系

王建儿 贺兰花 林伟华 郑元秀 汪铁军

急性缺血性脑卒中发病急、变化快、致死致残率高，占全部脑卒中的60～80%，是脑卒中最常见的类型[1]，严重危害人类健康。作为重要的应激源，近年来，急性缺血性脑卒中诱发的肠道黏膜屏障功能障碍（intestinal barrier functional disturbance，IBFD）受到了越来越多的关注[2-4]。IBFD可引起肠道细菌及内毒素易位，导致肠源性感染的发生，诱发或加重多器官功能障碍，严重影响缺血性脑卒中预后。闭锁蛋白1（claudin1）和闭锁蛋白 4（claudin4）是反应肠道黏膜紧密连接的重要指标，在维持上皮细胞极性和调节肠屏障的通透性等方面起重要作用[5]。本研究旨在观察急性缺血性脑卒中患者血清claudin-1、claudin-4的变化，以期为急性缺血性脑卒中IBFD的防治与预后提供理论和实验依据。

1 临床资料

1.1一般资料 选取2015年3月—2016年2月杭州市余杭区第二人民医院神经内科住院的急性缺血性脑卒中患者78例为观察组，男44例，女34例，平均年龄（68.45±9.82）岁。对照组40名选自我院健康体检者，男 23名，女 17名，平均年龄（65.23±10.39）岁，均无脑血管病史、无创伤手术等应激源及肠道疾病病史。两组患者性别构成比及年龄差异均无统计学意义（P＞0.05）。

1.2急性缺血性脑卒中患者纳入与排除标准 纳入标准：（1）符合2014年中华医学会神经病学分会制订的《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》中急性缺血性脑卒中诊断标准[1]：急性起病；局灶性神经功能缺损，少数为全面神经功能缺损；症状和体征持续数小时以上；头颅CT或MRI排除脑出血和其他病变；脑CT或MRI有责任梗死病灶。（2）年龄50～80岁。（3）患者家属签署知情同意书。（4）急性缺血性脑卒中为首次发作者。（5）发病24h内就诊，住院时间＞14d。排除标准：（1）严重心肝肾等脏器功能衰竭患者；（2）原有肠道疾病患者；（3）存在其他严重创伤、手术、精神疾病等应激源；（4）既往有精神疾病患者；（5）正在接受放化疗的肿瘤患者。

2 方 法

2.1血清二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）、内毒素（endotoxin，ET）、claudin-1及claudin-4含量测定

所有患者分别于发病24h、3d、7d及14d四个时间点空腹采静脉血10mL（对照组于入组当日清晨空腹采取静脉血 10mL）置于室温下放置 1h后，4℃2000r/min离心7min，取上清液置-70℃冰箱保存。采用酶联免疫吸附试验法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）测定血清二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）、内毒素（endotoxin，ET）、claudin-1 及claudin-4含量。DAO ELISA试剂盒由上海信裕生物科技有限公司提供（批号XY-E10955），ET ELISA试剂盒由上海丰寿实业有限公司提供（批号fs-（a）-1686），claudin-1（批号 187362）及 claudin-4（批号187341）ELISA试剂盒均由ZYMED公司提供。使用美国biotek宝特ELX50型酶标仪进行检测。

2.2统计学方法 应用SPSS11.5软件，计量资料以（x±s） 表示，经方差齐性检验后两组比较采用配对t检验。组间各时间点比较采用重复测量资料的方差分析（ANOVA），相关性及回归分析采用Spearman及线性回归进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1两组研究对象血清DAO、ET含量比较 与对照组比较，观察组发病24h时血清DAO、ET含量均显著升高（P＜0.01），随后的 3d、7d 及 14d，观察组血清DAO、ET含量均持续高水平表达，在14d时，观察组血清DAO、ET含量呈下降趋势，但仍明显高于对照组及发病 24h 时（P＜0.05，P＜0.01），见表 1。

3.2两组研究对象血清claudin-1及claudin-4含量比较 与对照组比较，观察组24h时血清claudin-1含量显著下降（P＜0.01），而血清claudin-4含量则明显上升（P＜0.01）。随着时间的延长，观察组血清claudin-1含量呈上升趋势，而血清claudin-4含量则出现下降趋势。至14d时，观察组血清claudin-1含量仍明显低于对照组，但较发病24小时有所升高（P＜0.05）；而血清claudin-4含量仍明显高于对照组，但较发病24h时有所降低（P＜0.05），见表2。

表1 两组研究对象血清DAO、ET含量比较（x±s）

表2 两组研究对象血清claudin-1及claudin-4含量比较（pg/mL，x±s）

3.3相关及回归分析 claudin-1含量与血清DAO、ET 含量呈明显负相关（r=-0.678、-0.724，P＜0.01）；claudin-4含量与血清DAO、ET含量呈明显正相关（r=0.634、0.828，P＜0.01）。

4 讨论

缺血性脑卒中作为急性应激源所引起的消化道症状临床中十分常见[6]，其诱发的IBFD亦受到了越来越多的关注[2-4]。肠道作为应激反应的中心器官[7]，当机体出现急性应激反应时，交感-肾上腺髓质系统强烈兴奋，肠道血管收缩，血流量减少，使肠黏膜组织供氧减少，肠道通透性增加，从而导致原先正常寄生于肠道内的微生物及其毒素发生移位，越过肠黏膜屏障大量侵入肠道以外的组织，如肠壁浆膜、肠系膜淋巴结、门静脉以及其他远处器官，引发肠源性的全身感染，甚至导致多器官功能障碍综合征。因此防治IBFD对于改善缺血性脑卒中的预后具有重要意义。

目前，临床上常通过测定外周血血清ET及DAO水平反应肠道黏膜屏障功能指标[8]。ET是G-细菌细胞壁的脂多糖成分，细菌死亡溶解时释放入血，IBFD时会向肠腔外迁移，引起发热、微循环障碍等内毒素休克症状，监测外周血中的ET水平，是了解肠通透性的重要手段。DAO存在于小肠黏膜绒毛上层内的高度活性的细胞内酶，当肠道黏膜细胞受损时释放入血，或随坏死脱落的肠黏膜细胞进入肠腔。由于DAO在外周血中活性稳定，因此测定外周血DAO水平能较早体现肠黏膜的完整性和损伤程度[9]。本研究发现，与对照组比较，观察组发病24h时血清DAO、ET含量均显著升高（P＜0.01），提示急性脑卒中患者较早出现了IBFD，导致肠源性内毒素血症的发生。

肠道黏膜上皮细胞紧密连接对维持肠上皮机械结构完整和正常功能有重要作用[10]。紧密连接由claudins、咬合蛋白（occludin）和连接黏附分子（junction adhesion moleucule，JAMs）3 种膜蛋白及闭合小环蛋白（ZO-1、ZO-2和 ZO-3）组成。其中 claudins功能最为重要，是构成紧密连接的主要骨架蛋白。Claudin-1和Claudin-4是claudins家族的主要成员之一，分子量在22～27kDa之间，有4个疏水跨膜区、两个细胞外环形结构和位于胞质中的羧基端、氨基端。Claudin-1、Claudin-4的异常表达可引起IBFD，导致紧密连接功能失调和组织渗透性的增加，是包括肠易激综合征、炎症性肠病等多种疾病的共同病理学基础。Claudin-1表达升高使肠黏膜紧密连接通透性下降，水和电解质渗出困难，形成便秘；而Claudin-4表达降低则可使其通透性增强，水和电解质渗出增多，形成腹泻[5]。本研究发现，观察组发病24h时血清claudin-1含量较对照组显著下降（P＜0.01），而血清 claudin-4 含量则明显上升（P＜0.01），可能由此导致肠黏膜通透性增加，造成肠黏膜屏障功能损伤。此外，本研究通过动态观察指标变化，发现患者血清ET 24h、DAO 3d达到高峰水平，随后呈缓慢下降趋势，血清claudin-4含量出现了与血清DAO、ET同向的变化趋势。血清claudin-1含量在24h时达最低值且明显低于其他时间点，随着时间的延长，在3、7、14d呈明显上升趋势。分析可能的原因是急性缺血脑卒中引起肠道早期的缺血低氧可能是早期肠黏膜通透性改变的主要原因，而随后肠道的代偿机制和修复反应一定程度上减轻了这些损伤[10]。相关性分析表明，claudin-1含量与血清DAO、ET含量呈明显负相关，claudin-4含量与血清DAO、ET含量呈明显正相关，提示由claudin-1、claudin-4蛋白组成的紧密连接的破坏与肠黏膜损伤密切相关，是IBFD的重要分子机制。

综上所述，急性缺血性脑卒中时，患者存在明显的IBFD，肠黏膜紧密连接蛋白claudin-1、claudin-4表达异常导致紧密连接结构破坏可能是发生IBFD的重要机制。

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