GC-MS/SIM法同时测定臭冷杉挥发油中柠檬烯和醋酸龙脑酯含量

任恒鑫，吕玉光，宗希明，牟立婷，张舒婷，宋春香，孙长海

(佳木斯大学 药学院，黑龙江 佳木斯 154007)

松科植物臭冷杉[Abiesnephrolepis(Trautv.) Maxim.]又名臭松、东陵冷杉，在我国主要分布在东北的长白山脉和小兴安岭地区[1-4]。现代药理学研究表明，臭冷杉挥发油具抗炎、镇咳、平喘和清除自由基的作用[5-7]，并可作为食品加香剂、调味剂、防腐剂和抗氧化剂,广泛应用于医药、食品、日用化工等行业，极具市场开发价值[8]。

柠檬烯和醋酸龙脑酯为臭冷杉挥发油中两种主要有效成分，是评价臭冷杉原药材质量的重要指标[9-10]。臭冷杉挥发油中柠檬烯和醋酸龙脑酯的测定方法文献报道多为气相色谱法[11-12]。本文首次建立了气相色谱-质谱联用结合选择性离子检测技术同时测定臭冷杉挥发油中柠檬烯和醋酸龙脑酯含量的方法，并对采集于小兴安岭不同地区的样品进行了测定，为臭冷杉生药质量评价提供了理论依据。

1 仪器与试剂

Agilent 7890GC/5975MSD型气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦公司)；臭冷杉药材分别采于小兴安岭10个地区，经佳木斯大学药学院宗希明高级实验师鉴定为松科、冷杉属植物臭冷杉[Abiesnephrolepis(Trautv.) Maxim.]的新鲜枝叶和松脂；柠檬烯对照品(中国药品生物制品检定所，批号100470-200801)；醋酸龙脑酯对照品(中国药品生物制品检定所，批号110759-200604)；其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 实验条件

2.1.1 色谱条件

色谱柱为30 m×0.25 mm×0.25 μm HP-5MS石英毛细管柱，进样口温度280 ℃，初始柱温40 ℃，以4 ℃ ·min-1升至260 ℃，载气为氦气，分流比为100∶1，进样量1 μL。

2.1.2 质谱条件

标准EI源(70 eV)，离子源温度为230 ℃，接口温度为280 ℃，四极杆质量分析器，扫描范围30～450 amu，扫描速度为3.46 scans/s。采用 SIM(选择离子为68和95) ，采集延迟7.5 min。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液的配制

分别取柠檬烯和醋酸龙脑酯对照品适量(约200 mg)，精密称定，置10 mL容量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀，即得浓度为mg ·mL-1的对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液的配制

取臭冷杉枝叶粉末约50 g，或松脂约10 g，精密称定，置于挥发油提取器中，加水500 mL，按《中国药典》2015年版(四部) 通则2204挥发油测定法[13]提取挥发油 6 h，得淡黄色挥发油。加适量无水硫酸钠脱水，振摇，静置。将脱水后的挥发油置5 mL量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 色谱行为

在上述色谱条件下，柠檬烯和醋酸龙脑酯对照品和样品的选择离子扫描色谱图见图1A和1B。柠檬烯和醋酸龙脑酯质谱图分别见图2和图3。

图1 柠檬烯和醋酸龙脑酯对照品的选择离子扫描

图2 柠檬烯(limonene) 质谱图

图3 醋酸龙脑酯(bornyl acetate) 质谱图

2.4 线性关系考察

分别精确量取柠檬烯和醋酸龙脑酯对照品储备液，用正己烷制成含柠檬烯浓度分别为400，800，1 600， 2 400，3 200，4 000 μg·mL-1; 醋酸龙脑酯浓度分别为800，1 600，3 000， 4 800， 6 400 μg ·mL- 1的系列混合对照品溶液。按上述色谱条件进样。以浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程为y=12 042x+ 2 06(r=0.999 7)和y=13 13x+7 06(r=0.999 8)。结果表明，柠檬烯和醋酸龙脑酯检测浓度在400～4 000 μg ·mL-1和800～8 000 μg ·mL-1范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

取对照品溶液，按上述色谱条件，连续进样6次，计算柠檬烯和醋酸龙脑酯峰面积的RSD分别为 1.2%和1.4%，表明方法精密度良好。

2.6 稳定性试验

取供试品溶液，分别在 0，2，4，8，16 h时按上述色谱条件进样1 μL测定。结果柠檬烯和醋酸龙脑酯峰面积的RSD分别为1.6%和1.4%，表明供试品溶液在16 h内稳定。

2.7 重复性试验

取同一产地(伊春)臭冷杉样品6份，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样1 μL，计算柠檬烯和醋酸龙脑酯含量的RSD分别为1.3%和1.4% ，表明方法重现性良好。

2.8 加样回收率试验

取同一产地 (伊春) 臭冷杉样品6份，每份500 mg，精密称定，分别加入一定量的对照品储备液，按“2.2.2” 项下方法制备，按上述色谱条件进样1 μL，计算柠檬烯和醋酸龙脑酯平均加样回收率分别为98.5% 和98.7%；，RSD 分别为1.3%和1.5% 。表明方法回收率良好。

2.9 样品含量测定

取小兴安岭地区10个不同产地的臭冷杉不同部位挥发油样品，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样1 μL，依法测定各产地中的柠檬烯和醋酸龙脑酯含量。结果见表1。

表1 不同产地样品中柠檬烯和醋酸龙脑酯含量测定结果(n=10)

3 讨 论

3.1 相对于全扫描技术，选择性离子检测(Selected Ion Monitor) 技术使质谱仪将更多的时间用于检测选定质荷比离子的离子流，因而提高了分析灵敏度。该方法被广泛应用于医药、食品和环境监测等研究领域[14-16]。本文首次采用GC-MS/SIM法同时测定了臭冷杉挥发油中柠檬烯和醋酸龙脑酯含量。使用SIM模式使得该方法灵敏度更高，分析结果更为准确可靠。研究结果为臭冷杉药材的质量标准建立奠定了基础。

3.2 测定结果表明小兴安岭地区臭冷杉样品中柠檬烯和醋酸龙脑酯含量较高，明显高于文献[11-12]报道的吉林延边地区及长白山地区臭冷杉挥发油中柠檬烯和醋酸龙脑酯含量。其中伊春产地臭冷杉挥发油中柠檬烯和醋酸龙脑酯含量最高，是否与地理、气候等综合因素有关，还有待进一步研究。

3.3 测定结果表明臭冷杉不同部位挥发油中柠檬烯和醋酸龙脑酯含量不同，松叶>松枝>松脂，其中松叶和松枝中柠檬烯和醋酸龙脑酯含量较接近，但均大于松脂中含量，原因可能是由于采集的松脂暴露于空气中产生化学变化所致。

参考文献：

[1] Academy of Traditional Chinese Medicine and Material Medical of Jilin Provincial Medicinal Plant. Flora of Changbai Mountain[M]. Changchun: Jilin People’s Publishing House, 1982.

[2] 周恩宝. 松科植物松叶挥发油化学成分的研究[D].佳木斯：佳木斯大学,2009.

[3] 任恒鑫,苏瑞,张舒婷,等. GC-MS结合化学计量学解析法分析臭冷杉针叶挥发油成分[J]. 中草药,2012(8):1499-1502.

[4] 徐永红,申仁花,李东浩,等. 延边地区臭冷杉精油化学成分的研究[J]. 延边大学学报(自然科学版),1994(4):39-42.

[5] LIU W, ZHOU Z C, SHI H B, et al . Actions of relieving cougher moving phlegm and antiasthma of essential oil in Abies nephrolepis[J]Chin Tradit Herb Drugs, 1990, 2(6) : 268-271.

[6] BAKKALI F, AVERBECK S, AVERBECK D, et al. Biological effects of essential oils - A review[J]. Food Chem Toxicol, 2008, 46(2): 446-475.

[7] 尹有干. 冷杉针叶提取物促生长作用及抑菌活性研究[D].合肥：安徽农业大学,2014.

[8] 方纪,侯林英,侯祥瑞. 冷杉的开发与利用概况[J]. 长春大学学报,2006(2):67-69.

[9] 方洪壮,赵晨曦,周恩宝. 小兴安岭7种松叶挥发油GC-MS数据的分析[J]. 计算机与应用化学,2010(4):480-484.

[10] 薄采颖,郑光耀,宋强. 马尾松、樟子松、臭冷杉针叶精油的化学成分比较研究[J]. 林产化学与工业,2010(6):45-50.

[11] 王威,闫喜英,师海波,等. 气相色谱法测定臭冷杉挥发油中醋酸龙脑酯含量[J]. 药物分析杂志,2004(3):244-246.

[12] 王威,赵志兰，牛志多,等.毛细管气相色谱法测定臭冷杉挥发油中柠檬烯含量 [J].中草药,2003,34(7):605-607.

[13] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(四部)[S]. 北京: 化学工业出版社, 2015: 通则2204.

[14] 孙啸涛,张锋国,董蔚,等. GC-MS/SIM法测定芝麻香型白酒中3-甲硫基丙醇[J]. 中国食品学报,2015(2):214-222.

[15] 雷书凤,王海燕,苑泉,等. SPE-GC-MS/SIM测定水节霉发生地河水中半挥发性有机物[J]. 环境科学研究,2014(6):670-675.

[16] 关皓月,赵霞,孙会敏. GC-MS/SIM法测定明胶空心胶囊中的邻苯二甲酸酯类化合物[J]. 中国新药杂志,2013(4):482-485.