TGF-β1介导人乳牙牙髓干细胞分化为血管平滑肌细胞的研究

胡露露，艾 琦，胡晓燕，杨 梓，王银龙，沈 军

目前，体外构建人工血管的主要策略是利用提取的原代血管构成细胞，如人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)和功能性血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，vSMCs)重新构建血管。然而，较难的原代细胞分离技术、有限的原代细胞增殖能力，以及人体组织来源的稀缺性，严重阻碍了原代细胞的实际运用。因此，诱导干细胞成为内皮细胞或血管平滑肌细胞成为解决该问题的主要思路。

转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)目前较广泛地用于诱导干细胞分化成平滑肌细胞[1]。研究[2]表明，TGF- Smads信号通路对于诱导多能干细胞分化成平滑肌细胞起到关键作用。 TGF-β1既可单独也可以联合其他因子共同诱导干细胞分化为平滑肌细胞，例如TGF-β1和骨形态发生蛋白4可以诱导脂肪干细胞分化为平滑肌细胞，TGF-β1联合血小板衍生因子BB可以诱导人胚胎干细胞分化平滑肌细胞。因此，该研究的目的是采用TGF-β1生长因子诱导人乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)分化为vSMCs，并探索分化的可能机制。

1 材料与方法

1.1细胞提取及培养收集脱落的乳牙，无菌下提取牙髓组织，剪碎后放入I型胶原酶和中性蛋白酶混合液中消化1 h，然后使用孔径为70 μm的细胞筛进行过滤，488 r/min离心5 min，完成后用常规DMEM培养基(含10%FBS和1%P/S)重悬并转入T25细胞培养瓶，37 ℃、5%CO2培养箱常规培养，每3 d换液一次，待生长到70%时消化转入到T75细胞培养瓶，扩大培养后用于后续实验。在SHED进行vSMCs诱导前，对其“多能性”进行评估，使用流式细胞仪检测SHED的干细胞标志物(CD45、CD90、CD105、CD73)表达情况，并做成脂、成神经和成骨等多向分化能力的鉴定。原代HUVECs和vSMCs购自美国ScienCell公司，并用相应的培养基培养(平滑肌细胞培养基和内皮细胞培养基均购自美国ScienCell公司)，作为阳性对照。

1.2诱导SHED分化为vSMCs取第4～6代SHED，按照3×103cells/cm2接种，常规DMEM培养基培养，待细胞贴壁后，换成vSMCs诱导培养基(5% FBS DMEM+不同浓度2.5、5、10、20、30 ng/ml TGF-β1)，获得诱导后不同时间点SHED-vSMCs。

1.3RT-qPCR按照RNA提取试剂盒说明，提取细胞样本的总RNA，取1 μg的总RNA，按照TaKaRa逆转录试剂盒说明，转成20 μl cDNA，并同样按照TaKaRa SYBR Premix Ex Taq II试剂盒说明，完成PCR反应。本实验所用引物序列如下：GAPDH上游引物：5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′,下游下物：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′; α-SMA上游引物：5′-CCGACCGAATGCAGAAGGA-3′,下游引物：5′-ACAGAGTATTTGCGCTCCGAA-3′; SM22α上游引物：5′-AGTGCAGTCCAAAATCGAGAAG-3′,下游引物：5′-CTTGCTCAGAATCACGCCAT-3′;Calponin上游引物；5′-GTCAACCCAAAATTGGCACCA-3′,下游引物：5′-ACCTTGTTTCCTTTCGTCTTCG-3′。

1.4Westernblot用RIPA裂解液冰上裂解样本20 min，后高速离心15 min，收集上清液并用BCA蛋白浓度测定试剂盒测量样本的蛋白浓度，然后根据测量得到的蛋白浓度，计算20 μg样本蛋白所需的剂量，进行Western blot实验。本实验所用抗体如下：鼠单克隆抗β-actin抗体(编号：sc-47778)购自美国Santa Cruz公司;兔多克隆抗SM22 alpha抗体 (编号：ab14106)、兔抗Calponin抗体 (编号：ab46794)购自英国Abcam公司。

1.5免疫荧光在诱导前将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中进行诱导，完成诱导后用冰PBS洗2次，然后4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，每次5 min，然后用0.5%的Triton-100通透细胞5 min，PBS洗3次，每次5 min；使用2%BSA封闭细胞1 h，然后根据具体的蛋白孵不同的一抗，4 ℃房过夜，PBS洗3次，每次5 min后孵二抗1 h，PBS洗3次，每次5 min；封片后荧光显微镜检查目的蛋白。本实验所用抗体如下：α-SMA (编号：A2547)购自德国Sigma-Aldrich公司；SM22 alpha (编号：ab14106)、SMMHC (编号：ab683)、Calponin (编号：ab46794)为一抗，羊抗鼠Alexa Fluor 488(编号：ab150117)和羊抗兔Alexa Fluor 488(编号：ab150077)为二抗，均购自英国Abcam公司。

1.6体外Matrigel血管生成实验为了研究SHED诱导分化的vSMCs是否可以促进血管结构的稳定性，本研究使用体外Matrigel血管生成实验，评估SHED-vSMCs在维持血管结构稳定性中的作用。将5×105～8×105个细胞接种到T25培养瓶，以便细胞24 h后达到80%融合；并将Matrigel从-70 ℃冰箱移放到4 ℃冰箱，同时将48孔板和1 ml枪头置于4 ℃冰箱；第2天在冰上用预冷的1 ml枪头将Matrigel转入预冷的48孔板(120～200 μl每孔)，迅速置于37 ℃培养箱30 min；常规消化细胞，按照5 ∶1比例将HUVECs和SHED-vSMCs用内皮细胞培养基重悬成浓度为3.2×105cells/ml的单细胞悬液，然后取100 μl该单细胞悬液轻轻滴在已经凝固的Matrigel表面，并继续37 ℃培养箱常规培养；于不同时间点在显微镜下观察小管形成情况并随机选择5个视野拍照记录，然后用Image J 软件进行分析。

2 结果

2.1酶消化法提取的SHED具有多能干性如图1所示，流式细胞仪结果显示SHED表达干细胞标志物CD105，CD90以及CD73，不表达CD45。图2进一步显示了SHED具有成骨、成神经以及成脂能力。

2.2TGF-β1可诱导SHED分化为vSMCs如图3A所示，诱导7 d后，TGF-β1上调了vSMCs特异性标志物(α-SMA、SM22α和Calponin)的mRNA表达水平，不同浓度(10、20、30 ng/ml)之间结果差异无统计学意义。因此，在进一步研究中仅使用10 ng/ml TGF-β1的剂量。

为了获得最佳的诱导时间，本研究评估不同时间点(第3、5、7天以及第1、2代)10 ng/ml TGF-β1的诱导效果。如图3B、C所示，vSMCs表型标志物的表达在第5天达到最高水平，第7天略有下降，诱导效果能维持到第1和第2代。免疫荧光结果(图4)进一步表明了诱导后的SHED表达vSMCs标志物。

为了评估SHED诱导为vSMCs的分化效率，通过流式细胞术来分析α-SMA、SM22α、Calponin和SM-MHC阳性细胞的百分比。结果如图5所示，这些标志物具有较高的表达(α-SMA86.1%，SM22α 93.9%，Calponin 56.8%，SM-MHC 88.2%)。

图1 细胞流式仪结果A：CD105 ；B：CD90 ；C：CD73；D：CD45

图2 SHED具有成骨、成神经及成脂能力A：SHED成骨诱导，茜素红染色；B：SHED成神经诱导×4；C：SHED成脂诱导，油红o染色×4

图3vSMCs特异标志物在基因水平和蛋白水平上的表达

A:不同浓度TGF-β1诱导下α-SMA、SM22α和Calponin的mRNA表达水平；B、C:10 ng/ml TGF-β1在不同时间点的诱导效果；1：对照组；2：2.5 ng/ml；3：5 ng/ml；4：10 ng/ml；5：20 ng/ml；6：30 ng/ml；7：第3天；8：第5天；9：第7天；10：第1代；11：第2代；12：原始vSMCs

图4 免疫荧光下vSMCs标志物的表达 免疫荧光染色×20

图5 SHED诱导vSMCs具有较高的诱导效率

2.3SHED诱导分化的vSMCs表现出与原代vSMCs相似的功能特性Matrigel血管形成实验结果表明，诱导SHED分化的vSMCs具有与原代vSMCs相类似的功能。如图6A所示，SHED诱导分化的vSMCs紧密附着在HUVEC形成的三维血管结构的表面，并显著增加了血管结构的存活时间(图6B)。

3 讨论

血管化组织工程复合体的构建是制约组织工程技术在临床上有效应用的关键问题。如何让体外构建的组织器官快速获得血供，从而保证其早期存活以及功能维持，是组织工程学研究的一个热点和难点。目前，最有效的策略是在体外构建组织器官过程中同时进行预血管化[3]。预血管化组织工程复合体可以迅速与受体形成血管吻合，从而快速建立血液循环，确保构建组织器官内部的营养供应以及代谢物质的排除。预血管化的方案主要是将血管组成细胞，包括血管内皮细胞和血管壁细胞(血管周平滑肌细胞vSMCs以及周细胞Pericytes)，植入人工支架，通过细胞在支架内的增殖以及分化，最终形成类似机体的血管样结构[4]。因此，用于构建血管的种子细胞特性及组织来源对预血管化起到决定性作用。受体自身血管组织被认为是最合适的细胞来源，然而由于提取困难、细胞数量不足及增殖率低等因素，目前无法在实验及临床中进行广泛应用。干细胞具有多向分化潜能、增殖速度快、来源广泛等优势，利用干细胞作为种子细胞运用于组织工程具有诱人的临床应用前景。

目前，在组织工程预血管化研究中，研究较多的有胚胎干细胞和诱导多能干细胞。有胚胎干细胞和诱导多能干细胞是一类具有自我更新、无限增殖和多向分化潜能的细胞，能够被诱导为几乎机体所有类型的细胞。然而，获取有胚胎干细胞所产生的伦理问题和使用过程中存在的免疫排斥反应，以及生成诱导多能干细胞的过程中可能会出现的危险变异从而导致产生一些未知的疾病，使得利用有胚胎干细胞/诱导多能干细胞作为种子细胞处于严重窘境。

最近研究[5]表明，成体干细胞(骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞以及血管内皮前体细胞)同样具有定向分化为vSMCs的潜能，然而，获取这些成体干细胞需要较为繁琐的手术过程，以及常规诱导方法血管内皮细胞诱导效率过于低下等问题，限制了其将来的临床应用前景。相对于上述成体干细胞，SHED具有以下优势：① SHED来源于自然脱落的乳牙，不会对供者产生任何额外的损害；② 由于是自身来源，从而也避免了免疫排斥反应；③ 除了表达早期间充质干细胞标志物STRO-1和CD146等，SHED亦表达胚胎干细胞的标志物Oct4、Nanog、SSEA-3、SSEA-4[6]，并具有多向分化能力，如可以分化为成骨/成牙本质细胞，脂肪细胞，神经细胞。另外，SHED最近还被证实能够分化为内皮细胞[7]，然而，尚未有SHED分化为vSMCs的报道。在本研究中使用生长因子TGF-β1诱导SHED，结果表明SHED可以分化为功能性的vSMCs。

图6 Matrigel血管生成实验结果 免疫荧光染色×10

本研究采用α-SMA、SM22α、Calponin，SM-MHC作为鉴定vSMCs的表型标志物，其中SM-MHC只在可收缩性的vSMCs中表达，结果表明，SHED在生长因子TGF-β1刺激下，表达这些vSMCs标志物。成熟vSMCs同时还需具有相应功能，例如稳定血管的能力，促进血管形成能力，以及收缩功能。为了评价SHED来源的vSMCs的血管稳定能力，本研究进行了Matrigel血管生成实验，将HUVECs与SHED诱导分化来源的vSMCs在Matrigel上进行共培养，HUVECs在Matrigel上能够形成血管状结构，SHED-vSMCs能够稳定HUVECs形成的血管结构，证明了SHED来源的vSMCs具有相应的功能。

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