饲料中添加低聚木糖对凡纳滨对虾幼虾消化酶活力、肠道形态及细菌数量的影响

陈晓瑛 王国霞 孙育平 陈 冰 莫文艳 赵红霞 曹俊明 黄燕华*

(1.广东省农业科学院动物科学研究所，广州 510640；2.农业部华南动物营养与饲料重点实验室，广州 510640；3.广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广州 510640；4.广州飞禧特生物科技有限公司，广州 510640)

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)是当今世界养殖产量最高的对虾三大优良品种之一，是我国对虾的主导养殖品种和重要出口水产品之一，具有生长快、抗病力强等优点，养殖经济效益显著。然而，随着集约化、规模化养殖模式及饲料中鱼粉替代比例升高，对虾疾病逐渐增多，抗生素及其他药品的滥用，导致对虾代谢紊乱，免疫力和抗病力下降，肠道健康受到威胁，严重影响对虾产业的可持续发展。目前，通过营养手段调控肠道健康来降低疾病的发生，减少药品的使用已成为现代营养学研究的热点之一。因此，寻找和开发绿色环保、安全有效的无抗添加剂，研究其调控对虾的肠道健康具有重要意义[1]。

功能性寡糖是一种新型饲料添加剂[2]。低聚木糖(xylo-oligosaccharides，XOS)是功能性寡糖常用种类，是低度聚合糖，有效成分主要是木二糖和木三糖。与其他功能性寡糖相比，XOS具有独特的性能，包括不易被动物的消化酶分解、有独特的酸和热稳定性、无配伍禁忌、可显著增殖双歧杆菌等特点，并在低剂量添加就能表现出显著效果。有研究发现，XOS具有维持畜禽动物肠道微生物区系的稳定性、促进有益菌增殖、抑制有害菌的生长、改善消化道结构、增强机体免疫和抗氧化能力、促进生长等作用[3-6]。有研究发现，饲料中添加XOS或合生素能提高刺参(ApostichopusjaponicusSelenka)和草鱼(Ctenopharyngodonidellus)肠道蛋白酶和淀粉酶活力[7-8]；提高草鱼肝胰腺的胰蛋白酶、脂肪酶活力[8]；提高草鱼[9]、奥尼罗非鱼(Oreochromisaureus×O.niloticus)[10]和凡纳滨对虾[11]肠道中双歧杆菌等有益菌数量，减少肠道中大肠杆菌或弧菌等有害菌数量。但研究XOS对凡纳滨对虾肠道消化酶活力及肠道功能的影响尚未见报道。为此，本试验在前期研究XOS对凡纳滨对虾幼虾生长性能和免疫、抗氧化功能作用效果[12]的基础上，研究了饲料中添加XOS对凡纳滨对虾消化酶活力、肠道形态和细菌数量的影响，以便为XOS在甲壳动物饲料中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

以鱼粉、豆粕和花生粕为主要蛋白质源，以鱼油和大豆磷脂为主要脂肪源，以面粉为主要碳水化合物源，配制蛋白质和脂肪水平分别为41.90%和6.03%的基础饲料，其组成及营养水平见表1。在基础饲料中分别添加200、400和600 mg/kg XOS(购自山东龙力生物科技有限公司，纯度95%)，配制3种试验饲料。各种原料粉碎后均通过60目筛，用SLX-80型双螺杆压机制成粒径为1.2～1.5 mm的颗粒料，55 ℃下烘干，冷却后过筛，放入密封袋中于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2 试验设计与饲养管理

试验用凡纳滨对虾虾苗由正大集团有限公司珠海种苗场提供。用暂养料驯养4周后，在广东省农业科学院动物科学研究所水产研究室的室内循环水养殖系统中进行饲养试验。对虾饲养于16个容积为350 L的玻璃纤维桶(直径80 cm，高70 cm，水体容积300 L)，进水速率为3.4 L/min。挑选体质健康、个体重量(0.67±0.02) g的凡纳滨对虾苗800尾，随机分为4组，每组4个重复，每个重复50尾虾。各组分别投喂基础饲料和在基础饲料中分别添加200、400和600 mg/kg XOS的3种试验饲料，分别记作G0(对照)、G200、G400和G600组。采用饱食投喂法，每天在08:00、14:00和20:00分3次投喂，投喂半个小时后收集残饵。每天观察对虾健康状况，记录死亡情况。试验水源为海水和自来水混合后的咸淡水，经过沙滤、消毒后添入，盐度为4.0‰～5.0‰，自然光照，水温28.5～32.0 ℃，pH 7.8～8.0，溶氧含量>6.0 mg/L，氨氮含量≤0.1 mg/L，亚硝酸盐含量≤0.01 mg/L。试验期为42 d。

表1 基础饲料组成及营养水平(风干基础)

1)每千克维生素预混料含有 Per kg vitamin premix contented： VA 4 000 000 IU，VD32 000 000 IU，VE 30 g，VK310 g，VB15 g，VB215 g，VB68 g，泛酸钙 calcium pantothenate 25 g，叶酸 folic acid 2.5 g，生物素 biotin 0.08 g，烟酸 nicotinic acid 30.15 g，VB120.05 g，肌醇 inositol 150 g。

2)每千克矿物质预混料含有 Per kg mineral premix contented：MgSO4·H2O 12 g，KCl 90 g，Met-Cu 3 g，FeSO4·H2O 1 g，ZnSO4·H2O 10 g，Ca(IO3)20.06 g，Met-Co 0.16 g，NaSeO30.003 6 g。

3)营养水平为实测值。Nutrient levels were measured values.

1.3 样品采集及指标检测

1.3.1 样品采集

饲养试验结束后，禁食12 h。每个重复中随机取3尾虾，剥离肠道，放入10%的福尔马林溶液中固定，用于肠道形态分析。每个重复再随机取3尾对虾置于冰盘内解剖，剥离对虾的胃、肠道和肝胰腺，剪开胃和肠道，用对虾生理盐水清洗胃、肠道内容物，用滤纸擦干表面水分，装入Eppendorf管中，置于-20 ℃冰箱中保存，用于胃、肠道和肝胰腺消化酶活力测定。同时，每个重复随机取3尾对虾，在无菌操作下，将对虾解剖，取出肠道装入Eppendorf管中，置于4 ℃冰箱内，用于肠道细菌数量测定。

肝胰腺、胃和肠道组织匀浆上清液：从-20 ℃冰箱中取出肝胰腺、胃和肠道样品，4 ℃解冻，然后称取一定质量的样品，剪碎，放入玻璃匀浆器中，加入6倍样品重的预冷的生理盐水，在冰浴中匀浆(T10 basic型电动玻璃匀浆机，IKA)，充分匀浆后，倒入离心管中，再加入3倍样品重的预冷生理盐水，冲洗匀浆器，倒入离心管，制成10%组织匀浆液。取一部分置于4 ℃冰箱，用于测定脂肪酶活力。其余以3 500 r/min离心10 min，取上清液，分装成2份，一份置于4 ℃冰箱保存，用于测定蛋白酶和淀粉酶活力；一份置于-80 ℃冰箱中保存，用于组织总蛋白(TP)含量测定。4 ℃冰箱内的肠道样品采用同样的匀浆方法，制成10%肠道匀浆液。

1.3.2 消化酶活力测定

蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力测定分别按王玉梅等[13]的方法、3,5-二硝基水杨酸显色法(DNS法)[14]和聚乙烯醇橄榄油乳化液水解法[15]。

1.3.3 匀浆上清液TP含量测定

制备肝胰腺和肠道匀浆上清液，以牛血清蛋白做标准，用考马斯亮蓝法测定[16]。

1.3.4 肠道组织切片观察

从10%的福尔马林溶液中取对虾肠道，常规法脱水，石蜡包埋，连续切片，用苏木精-伊红(HE)染色，树胶封片，在光学显微镜下观察其形态和结构的变化。按组织学样品采集与图像数据测量中的随机等距原则选取测量对象。肠壁厚度：在每张切片中随机测量30处肌层的厚度，取平均值。肠绒毛高度：从绒毛的顶端至肌部凹陷处的垂直距离表示，每张切片随机选取10处进行测量，取平均值。

1.3.5 肠道细菌数量测定

参考李继秋[17]的稀释涂布法。取10%匀浆液，依次以10倍系列稀释，充分振荡混匀，分别取0.1 mL的10-3、10-4和10-5菌液来涂布，每个重复的稀释菌液进行3个平行测定。在28 ℃培养箱中，无光照，培养基的pH为7.0～7.4，总菌和弧菌静止培养24 h，乳酸菌静止培养48 h。双歧杆菌为厌氧菌，菌液涂布后，再倒入一层40 ℃左右的双歧杆菌琼脂培养基(BBL琼脂培养基)，置于28 ℃培养箱中，无光照，静止培养48 h。根据菌落数可数性原则，对微生物进行平板菌落计数。选取菌落数为30～300的稀释度，求3个平行的菌落数平均值，并计算每克肠道所含的细菌数量，以对数值[lg(CFU/g)]表示。培养基均采购于广东环凯微生物有限公司。

1.4 数据统计分析

数据采用平均值±标准差表示。采用SPSS 17.0软件进行数据分析和统计，对数据作单因素方差分析(one-way ANOVA)。若组间差异显著，再用Duncan氏法进行多重比较，以P<0.05为差异显著。

2 结 果

2.1 饲料中添加XOS对凡纳滨对虾肠道、肝胰腺和胃消化酶活力的影响

由表2可知，与对照组相比，饲料中添加XOS能显著提高对虾肠道的淀粉酶和肝胰腺的蛋白酶活力(P<0.05)，对虾肠道、肝胰腺和胃的其他消化酶活力也有不同程度的提高。G200组对虾肠道、肝胰腺和胃的淀粉酶活力最高，显著高于对照组(P<0.05)。G200组对虾肠道的蛋白酶活力最高，其次是G400组，且均显著高于对照组(P<0.05)；G400组对虾肝胰腺和胃的蛋白酶活力最高，且显著高于对照组(P<0.05)。G400组对虾肠道的脂肪酶活力最高，且显著高于对照组(P<0.05)；对虾肝胰腺脂肪酶活力随着饲料中XOS添加量的增加而升高，其中G400和G600组显著高于对照组(P<0.05)。各组对虾胃的脂肪酶活力无显著差异(P>0.05)。

2.2 饲料中添加XOS对凡纳滨对虾肝胰腺和肠道TP含量的影响

由表3可知，各试验组对虾肝胰腺和肠道TP含量均高于对照组，并呈现先增加后减少的趋势，其中G400肝胰腺TP含量最高，显著高于对照组(P<0.05)，与其他试验组没有显著差异(P>0.05)。G400组肠道TP含量最高，但各组间差异不显著(P>0.05)。

表2 饲料中添加XOS对凡纳滨对虾肠道、肝胰腺和胃消化酶活力的影响

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表3 饲料中添加XOS对凡纳滨对虾肝胰腺和肠道TP含量的影响

2.3 饲料中添加XOS对凡纳滨对虾肠壁厚度和肠绒毛高度的影响

由表4可知，凡纳滨对虾肠壁厚度和肠绒毛高度均随着饲料中XOS添加量的增加呈先升高后降低的趋势，其中以G400组最高，且显著高于对照组(P<0.05)；而G400组对虾肠壁厚度与其他试验组无显著差异(P>0.05)。各组凡纳滨对虾肠道组织切片图见图1。

表4 饲料中添加XOS对凡纳滨对虾肠壁厚度和肠绒毛高度的影响

2.4 饲料中添加XOS对凡纳滨对虾肠道细菌数量的影响

由表5可知，各试验组的对虾肠道总菌和双歧杆菌数量显著高于对照组(P<0.05)，肠道弧菌(Vibrio)数量显著低于对照组(P<0.05)。各试验组乳酸菌数量不同程度地高于对照组，但各组间无显著差异(P>0.05)。

图中V表示肠绒毛，J表示肠壁。

V in the figure represented intestinal villus, and J represented the intestinal wall.

图1凡纳滨对虾肠道组织切片图

Fig.1 Intestinal section morphology diagram of

Litopenaeusvannamei(100×)

3 讨 论

3.1 饲料中添加XOS对凡纳滨对虾消化酶活力的影响

肠道是动物体内消化吸收的主要场所，其消化酶活力的高低反映基本的消化生理特征，直接影响动物对营养物质的吸收和利用，进而影响动物的生长和发育，是反映机体消化能力是否良好的重要指标。本试验中，随着饲料中XOS添加量的增加，肠道的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活力均先升高后下降，其总的变化趋势与本实验室前期研究中所呈现的增重率、特定生长率表现相似，其中G200组肠道的蛋白酶和淀粉酶活力显著高于对照组，该组的增重率和特定生长率也最好[12]。以上结果间接表明，肠道消化酶活力与生长指标具有一定的相关性。这与XOS在异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)[18]、奥尼罗非鱼[19]、仿刺参[7]和凡纳滨对虾[11]在肠道中的消化酶活力的研究结果相似。Sugita等[20]研究发现，肠道菌群在淡水鱼的淀粉消化中具有非常重要的作用。例如，双歧杆菌、乳酸杆菌及其代谢产物能够促进动物消化酶的分泌和肠道蠕动，从而提高肠道的消化酶活力，而有害菌会损害肠黏膜上的绒毛和微绒毛，减少消化酶的分泌[21]。本试验证实，XOS能促进有益菌双歧杆菌、乳酸菌等的增殖，抑制有害菌弧菌的生长。此外，XOS还可以增强肠绒毛高度和肠壁厚度。由此可知，XOS主要通过改善微生物区系和肠道组织结构来促进肠道消化酶的分泌。但是，试验中肠道TP含量与肠道蛋白酶活力变化趋势不一致，说明肠道中蛋白质沉积不仅受到蛋白酶活力的影响，可能还受其他因素(如肠道微生物数量)的影响。

表5 饲料中添加XOS对凡纳滨对虾肠道细菌数量的影响

目前，有关低聚寡糖对动物肝胰脏和胃的消化酶活力影响的研究报道很少，而且作用效果不一致。饲粮中添加果寡糖(fructooligosaccharide，FOS)对肉鸡[22]和饲料中添加XOS对凡纳滨对虾[23]消化道消化酶活力均无显著影响。而肖明松等[24]和熊沈学等[25]分别发现，在中华鳖(Trionyxsinensis)和异育银鲫的饲料中添加适量低聚寡糖，能显著提高肝胰脏蛋白酶活力。在本试验中，XOS能显著提高肝胰腺和胃的消化酶活力。对虾肝胰腺和胃各消化酶没有表现出与前期研究显示的生长性能之间的相关性。但是肝胰腺的TP含量的变化趋势与肝胰腺的蛋白酶活力的变化趋势一致，说明肝胰腺的蛋白质沉积与蛋白酶活力具有一定的相关性。

3.2 饲料中添加XOS对凡纳滨对虾肠道形态的影响

肠道健康是动物快速生长和保持健康的重要保障。其中肠道黏膜形态结构是机体消化吸收的结构基础，肠壁厚度、隐窝深度和绒毛高度的增加，可增强动物的消化吸收能力。目前关于低聚寡糖对动物肠道形态的研究有一定的进展，但XOS的研究较少。有学者发现，饲料中添加适量低聚寡糖能明显改善罗非鱼[10,26-27]、草鱼[28]、齐口裂腹鱼(Schizothoraxprenati)[29]的肠道形态。本试验结果发现，饲料中添加XOS能增加对虾肠道肠壁厚度和肠绒毛高度，这将有利于肠道吸收面积的增加和营养物质消化利用率的提高[30]。分析其原因，应该是XOS作为益生菌的增殖因子，促进了有益微生物大量增殖，调节了微生态平衡，改善了肠道组织形态和代谢功能[31]。另外，肠道中有益菌的代谢产物如丁酸、丙酸和乙酸等短链脂肪酸可以作为能源促进黏膜细胞增殖，有利于肠壁厚度和肠道绒毛高度的增加[32-33]。

3.3 饲料中添加XOS对凡纳滨对虾肠道细菌数量的影响

肠道细菌的组成和数量是评价肠道健康的重要指标。肠道细菌对肠细胞增殖、组织形态有极大的影响[34]，对营养物质的消化吸收、机体免疫、正常生长等起着重要作用。低聚寡糖影响肠道细菌的作用已经在畜禽和水产动物中有所报道，在饲料中添加适量的XOS能提高畜禽动物肠道内双歧杆菌和乳酸杆菌数量，降低有害菌大肠杆菌数量[34-38]。在水产动物奥尼罗非鱼[10]、草鱼[8]、刺参[39]等也有类似的效果。本试验亦证实，饲料中添加XOS对凡纳滨对虾肠道乳酸菌数量没有显著影响，但能显著提高双歧杆菌和总菌数量，显著降低弧菌数量。XOS作为有益菌的碳源，能增殖有益菌，使有益菌形成竞争优势，抑制了有害菌的定植，同时双歧杆菌等有益菌能形成一个生物学屏障组织阻止致病菌的侵入[39-40]。Pestova等[41]研究发现，XOS具有与许多病原微生物外源凝集素相似的结构物质，能竞争性与病原菌结合，由于XOS具有不被消化道内源酶分解的特点，可携带着病原菌排出，起到了防止病原菌在肠道内繁殖的作用。在这些作用下，XOS能显著增加有益菌增殖，抑制有害菌增殖。

4 结 论

饲料中添加适量的XOS能显著提高凡纳滨对虾幼虾消化酶活力，改善肠道形态，提高肠道总菌和双歧杆菌数量，降低弧菌数量。

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