饲粮铜水平对冬毛期水貂血清脂类代谢指标、血液参数、肠道消化酶活性及胆汁微量元素含量的影响

吴学壮 杨 颖 刘 志 高秀华* 杨福合 杨培龙 邢秀梅

(1.安徽科技学院动物科学学院，蚌埠 233100；2.中国农业科学院饲料研究所，农业部饲料生物技术重点实验室，北京 100081；3.中国农业科学院特产研究所，长春 130112)

铜是动物必需的微量元素，在动物能量代谢、血红蛋白(hemoglobin，Hb)合成和脂肪代谢等生理过程中发挥重要作用[1-2]。铜缺乏会影响动物对铁的吸收，进而影响造血功能[3-4]，而动物饲粮添加适宜的铜可以提高肠道脂肪酶的活性[5-7]，进而提高脂肪表观消化率[8-11]。此外，大量研究表明，动物饲粮添加铜可以降低血浆总胆固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)含量[12-14]。迄今为止，铜对畜禽生物学功能的研究有许多报道，而饲粮中添加铜对水貂脂质代谢、血红蛋白合成及肠道消化酶活性的影响还鲜有报道。为此，本试验以冬毛期水貂为试验对象，通过在其饲粮中添加不同水平的铜，研究铜对冬毛期水貂血清脂类代谢指标、血液参数、肠道消化酶活性及胆汁微量元素含量的影响，旨在揭示铜对于促进和改善动物生长性能和脂类代谢调控的理论机制，为铜的合理应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计与饲养管理

试验在农业部长白山野生生物资源重点野外科学观测试验站的毛皮动物生产基地展开。在毛皮动物生产基地随机选择健康、体重相近的(110±3)日龄水貂140只(公母各占1/2)。试验采用单因素随机试验设计，将140只试验水貂随机分为7个组，每组20个重复，每个重复1只水貂。以五水合硫酸铜(CuSO4·5H2O)为铜源，各组水貂分别饲喂在基础饲粮(铜含量为7.68 mg/kg)中添加0(对照组)、6(Cu6组)、12(Cu12组)、24(Cu24组)、(Cu48组)、96(Cu96组)和192 mg/kg(Cu192组)铜的试验饲粮。预试期7 d，正试期90 d。

试验水貂均单笼(40 cm×40 cm×60 cm)饲养，每日07:30与15:30各饲喂1次，自由采食，自由饮水，常规免疫。水貂目前没有统一的饲养标准，参照国内近几年水貂营养需要量的研究，配制冬毛期水貂基础饲粮，其组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)

1)每千克预混料含有 Contained the following per kg of the premix：维生素A醇 vitamin A retinol 1 000 000 IU，胆钙化醇 cholecalciferol 200 000 IU，生育酚醋酸酯 tocopheryl acetate 6 000 IU，硫胺素 thiamine 600 mg，核黄素 riboflavin 800 mg，钴胺素 cobalamin 10 mg，甲萘醌 menadione 100 mg，抗坏血酸 ascorbic acid 40 000 mg，烟酸 nicotinic acid 4 000 mg，泛酸 pantothenic acid 1 200 mg，生物素 biotin 20 mg，叶酸 folic acid 80 mg，胆碱 choline 30 000 mg，Fe 8 200 mg，Mn 1 200 mg，Zn 5 200 mg，I 50 mg，Se 20 mg，Co 50 mg。

2)代谢能为计算值，其他营养水平为实测值。ME was a calculated value, while the other nutrient levels were measured values.

1.2 样品采集

血液样品采集：饲养试验结束后，每组分别选取16只水貂，趾尖采血8～10 mL，置于促凝采血管和抗凝采血管各1/2。转移至实验室，3 500 r/min，4 ℃离心10 min，将分离出的血清分装在1.5 mL的Eppendor管中，置于-80 ℃中保存，备用。

组织器官样品采集：饲养试验结束后，每组分别选取水貂16只，首先空腹称重，之后各组水貂饲喂相应饲粮，60 min后，注射氯化琥珀胆碱处死，迅速解剖，分别取大约10 cm左右空肠和回肠，将用细线扎住肠道两端，投入液氮中速冻，随后从液氮中迅速取出，用解剖剪剪开肠段刮取肠道食糜于冻存管中，转入-80 ℃冰箱冷藏，待测肠道食糜胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 血清脂类代谢指标

采用磷酸甘油氧化酶-过氧化物酶(GPO-PAP)法检测血清TG含量，采用胆固醇氧化酶-过氧化物酶(COD-PAP)法检测血清TC含量，采用选择性清除法测定低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)含量。以上指标均用试剂盒测定，试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司。

1.3.2 血液参数

血红蛋白含量测定：采用氰化高铁(HICN)比色法测定血液血红蛋白含量，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

血细胞比容测定：采用温氏法测定血细胞比容。

1.3.3 肠道消化酶活性

未解冻前称取定量(0.5～1.0 g)的肠道食糜内容物，按质量体积比1∶9加入0.86%的生理盐水，匀浆粉碎，低温离心机离心2 500 r/min，离心10 min，取上清液。按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书操作，用SPECORD 50紫外光分光光度计测定吸光度，计算胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性。

1.3.4 胆汁微量元素含量

用移液器取2 mL胆汁样品于100 mL锥形瓶中，加10 mL优级纯硝酸，封口放置2 h，置于电炉上低温消煮至近干，将溶液无损失地转移到10 mL容量瓶中，使用VARIAN SpectrAA-240原子吸收分光光度计进行铜、锌、锰和铁含量的测定。

1.4 数据分析

试验数据采用SAS 9.13软件GLM程序进行统计分析，性别差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行显著性检验，组间差异采用Duncan氏法多重比较进行显著性检验；采用SAS 9.13软件REG程序，以饲粮铜水平为自变量，各种指标为效应因子，进行线性和二次曲线回归分析。其中P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结 果

2.1 饲粮铜水平对冬毛期水貂血清脂类代谢指标的影响

饲粮铜水平对冬毛期水貂血清脂类代谢指标的影响见表2。雄性水貂血清TC(线性，P<0.01；二次，P<0.05)和TG(线性，P<0.01；二次，P<0.01)含量随饲粮铜水平的增加呈线性或二次曲线降低。饲粮铜水平对雄性水貂血清HDL-C和LDL-C含量影响不显著(P<0.05)。对照组雄性水貂血清TC含量显著高于Cu96和Cu192组(P<0.05)；对照组雄性水貂血清TG含量极显著高于其他各组(P<0.01)，且其他各组之间差异不显著(P>0.05)；各组之间雄性水貂血清HDL-C和LDL-C含量差异不显著(P>0.05)。

雌性水貂血清TC含量随饲粮铜水平的增加呈线性和二次曲线降低(P<0.01)，雌性水貂血清HDL-C含量与饲粮铜水平呈线性升高(P<0.05)。饲粮铜水平对雌性水貂血清TG和LDL-C含量影响不显著(P>0.05)。对照、Cu6和Cu12组雌性水貂血清TC含量极显著高于Cu96和Cu192组(P<0.01)；对照和Cu6组雌性水貂血清TC含量显著高于Cu48组(P<0.05)；Cu6组雌性水貂血清TG含量显著高于Cu48组(P<0.05)，其他各组之间差异不显著(P>0.05)；对照组雌性水貂血清LDL-C含量显著高于Cu48组(P<0.05)，其他各组之间差异不显著(P>0.05)。雄性水貂的血清TC和TG含量显著高于雌性水貂(P<0.05)。

2.2 饲粮铜水平对冬毛期水貂血液参数的影响

饲粮铜水平对冬毛期水貂血液参数的影响见表3。饲粮铜水平对水貂血红蛋白含量和血细胞比容无显著影响(P>0.05)，雄性水貂水貂血红蛋白含量和血细胞比容与雌性水貂无显著差异(P>0.05)。

2.3 饲粮铜水平对冬毛期水貂肠道消化酶活性的影响

饲粮铜水平对冬毛期水貂肠道消化酶活性的影响见表4。饲粮铜水平对水貂空肠和回肠消化酶活性均无显著影响(P>0.05)。雄性水貂空肠、回肠胰蛋白酶活性和空肠淀粉酶活性极显著高于雌性水貂(P<0.01)，雄性水貂空肠脂肪酶活性显著高于雌性水貂(P<0.05)。

2.4 饲粮铜水平对冬毛期水貂胆汁微量元素含量的影响

饲粮铜水平对冬毛期水貂胆汁微量元素含量的影响见表5。水貂胆汁铜含量随饲粮铜水平的增加呈线性增加(P<0.05)，水貂胆汁锰和铁含量随饲粮铜水平的增加呈线性或二次曲线降低(P<0.01)。

表2 饲粮铜水平对冬毛期水貂血清脂类代谢指标的影响

同一项目同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

In the same column and the same item, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表3 饲粮铜水平对冬毛期水貂血液参数的影响

续表3项目Items血红蛋白Hb/(g/L)血细胞比容Hematocrit/%SEM1.380.10P值P-value线性Linear0.41240.9415二次Quadratic0.69100.9543雌性Female组别Groups对照Control217.454.91Cu6220.555.06Cu12218.555.20Cu24223.154.83Cu48224.355.20Cu96221.855.11Cu192221.855.09SEM1.380.10P值P-value线性Linear0.32700.7457二次Quadratic0.19040.8847雄性Male222.354.94雌性Female221.055.06

表4 饲粮铜水平对冬毛期水貂肠道消化酶活性的影响

续表4项目Items空肠Jejunum胰蛋白酶Trypsin/(U/mgprot)脂肪酶Lipase/(U/gprot)淀粉酶Amylase/(U/mgprot)回肠Ileum胰蛋白酶Trypsin/(U/mgprot)脂肪酶Lipase/(U/gprot)淀粉酶Amylase/(U/mgprot)P值P-value线性Linear0.7100.5460.6060.7190.5220.409二次Quadratic0.9240.4730.7270.9320.4420.663雄性Male8913A4705a572.8A8243A3834439.7雌性Female8464B4559b548.1B7746B3722438.6

表5 饲粮铜水平对冬毛期水貂胆汁微量元素含量的影响

-:未检出 not detected。

3 讨 论

3.1 饲粮铜水平对水貂血清脂类代谢指标的影响

大量研究表明，铜与血液脂类代谢存在密切相关性，动物饲粮添加铜能够影响动物体内脂类代谢，主要体现为饲粮添加铜可以降低血浆TC和TG水平[13-14]。但是，铜对动物体内脂类代谢的内在机制并不清楚，有待进一步研究。动物体内胆固醇主要由肝脏合成，部分来自食物。3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶是肝细胞合成胆固醇过程中的限速酶[15]，Kim等[16]研究发现，饲喂低铜水平饲粮时，小鼠肝脏细胞中HMG-CoA还原酶活性增加，胆固醇7α-羟化酶是在肝脏合成并促使胆固醇转化成胆酸的限速酶[17]。Tang等[18]研究表明，成年大鼠饲喂低铜水平饲粮时，胆固醇7-α羟化酶基因相对表达量降低80%，胆固醇7α-羟化酶活性降低，胆固醇转化发生障碍，导致高胆固醇血症。本研究结果表明，随饲粮铜水平的增加，血清中TC、TG和LDL-C含量都呈现降低的趋势，而饲粮铜水平没有影响血清HDL-C含量。

血清TC含量受年龄、性别、饮食等多种因素的影响，一般而言，雄性动物高于雌性动物。本研究结果显示，雄性水貂的血清TC和TG含量显著高于雌性水貂，其原因可能是由于冬毛期雄性水貂皮下脂肪和体重均高于雌性水貂。此外，水貂为严格的肉食性动物，血清TC含量高于人类和猪、牛、羊等动物。

3.2 饲粮铜水平对水貂血液参数的影响

铜在血液中主要以红细胞铜蓝蛋白和血浆铜蓝蛋白2种形式存在[19]。铜蓝蛋白可促使三价铁变为二价铁，促进胃肠道对铁的吸收，促进血红蛋白和卟啉合成[3-4]，此外，铜还可以促进幼稚红细胞的成熟和释放[3]。动物体内铜缺乏时，血浆铜蓝蛋白的活性降低，从而导致铁的价位转变发生障碍而引起贫血，血红蛋白合成受阻，铁代谢紊乱及红细胞减少，形成“低血铜症”(hypocupremia)[20]。本研究发现，饲粮铜水平对水貂血红蛋白含量和血细胞比容没有显著影响，这与Aulerich等[21]的研究结果相似。本研究结果表明，水貂饲喂基础饲粮，并未造成水貂铜的严重缺乏而引起血红蛋白含量和血细胞比容的改变。此外，水貂血红蛋白含量和血细胞比容性别差异不显著。

3.3 饲粮铜水平对水貂肠道消化酶活性的影响

大量研究表明，动物饲粮添加铜可以提高肠道脂肪酶的活性[5-7]，进而提高脂肪表观消化率[8-11]。动物肠道消化酶活性提高直接提高动物对营养物质的消化率，进而改善生长性能[6]。本研究结果表明，饲粮铜水平对水貂空肠和回肠胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性均无影响，但是脂肪酶活性随饲粮铜水平呈先增加后降低的趋势。分析其原因，可能由于水貂饲喂低铜水平的粮时提高了肠道脂肪酶活性，而水貂饲粮铜水平过高可导致铜中毒，进而导致肠道脂肪酶活性降低。影响动物肠道消化酶活性的因素很多，包括种间差异、生长阶段、饲粮组成和环境温度等[22]。

本研究结果表明，雄性水貂空肠胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性显著高于雌性水貂。前期研究结果表明，雄性水貂对粗蛋白质和粗脂肪消化率高于雌性水貂，得到客观证实。但是性别对水貂肠道消化酶活性影响的内在机制并不清楚，有待进一步研究。

3.4 饲粮铜水平对水貂胆汁微量元素含量的影响

胆汁是内源性铜的主要排泄途径之一[23-24]。研究表明，随着饲粮铜水平增加，胆汁铜含量有所升高，但是却没有成倍增加，然而胆汁铁、锰和锌含量却成倍降低。关于饲粮铜水平对胆汁铁、锰和锌含量影响的研究还处于空白。结合本研究结果推断，水貂饲喂不同铜水平的饲粮可以增加胆汁分泌量，从而导致胆汁铁、锰和锌含量降低。Czarnecki等[25]报道，饲粮铜水平低于250 mg/kg时，胆汁中铜含量不会增加；饲粮铜水平高于250 mg/kg时，胆汁中铜含量才会增加。Armstrong等[26]研究表明，饲粮添加225 mg/kg铜(硫酸铜)时，动物的胆汁铜含量较高；而与对照组相比，饲粮添加低水平(33、66、100 mg/kg)的铜却没有引起胆汁铜含量的升高。

4 结 论

① 随饲粮铜水平的增加，血清中TC、TG和LDL-C含量都呈现降低的趋势，而饲粮铜水平没有影响血清HDL-C含量。

② 饲粮铜水平没有影响水貂血红蛋白含量和血细胞比容的改变。

③ 水貂空肠和回肠脂肪酶活性有随饲粮铜水平先增加后降低的趋势。

④ 水貂血清脂类代谢指标和肠道消化酶活性存在性别差异，雄性水貂血清TC、TG含量和空肠胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性显著高于雌性水貂。

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