高效液相色谱-串联三重四极杆飞行时间质谱法鉴别五味子中木脂素成分

丁 博，陈文锐，王志元，谢建军，曾广丰，王 璐，佘志刚

五味子是传统中医药材原料，最早记载于东汉的《神农本草经》，具有悠久的食用历史；因为其有咸、甘、酸、辛、苦等味道，被成为五味子[1]。中国传统文化提倡药食同源，很多中药材都被作为膳食功能补品供人们食用，比如人参、灵芝等药材在一定食用量条件下，作为食品被人们食用。五味子主要化学成分为木脂素、挥发油、有机酸、维生素、萜类、多糖类等化学成分，其中木脂素类化合物主要生物药理活性成分，包括有五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲等[2]。我国学者研究表明，五味子木脂素类化合物具有护肝作用、抗氧化性、增强免疫力、抗疲劳等作用[3-5]。因此，许多保健食品用五味子作为功能作用原料，通过检测保健食品中五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲3 个化合物的含量，评估保健食品中五味子功效作用。

目前五味子木脂素类化合物检测方法主要高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）和液相色谱-质谱联用两种方法。张延妮等[6]利用反相-HPLC方法，采用紫外检测器检测南五味子中五味子醇甲、五味子酯甲和五味子乙素；窦志华[7]、赵玥[8]等用HPLC测定五味子种子及果皮中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素6 种含量，结果显示木脂素主要存在于种子中。胡俊扬[9]与沈晓君[10]等利用HPLC测定不同产地五味子中8 种木脂素成分，不同产地五味子中五味子醇甲为主要成分。有学者[11-13]提出中药有效成分的内在函数关系与比例关系，提出“一测多评”方法利用HPLC测定五味子醇甲成分评估其他4、6 种或8 种木脂素成分，并与外标法对比表明“一测多评”方法误差符合要求。谭春梅等[14]利用HPLC分析五味子和南五味子中指纹图谱，以木脂素指纹图谱分析评价五味子产品的质量。李晓亮等[15]利用HPLC测定五味子和南五味子中木脂素成分的指纹图谱，其中南五味子药材指纹图谱中标定25 个共有峰，显示不同产地五味子木脂素成分差异显著。高文新[16]采用超高效液相色谱联用高分辨质谱分析五味子提取物的木脂素成分，利用木脂素成分质谱行为差异，分别对南五味子和北五味子的木脂素成分进行比较分析。王宝莲等[17]应用HPLC联用紫外/质谱方法建立五味子醇提物的化学、体外代谢、体内药代和药效指纹图谱。由此可见，五味子中木脂素化合物主要为液相色谱检测方法，复杂样品基质严重干扰木脂素化合物的色谱分离、鉴定，需要研究开发质谱尤其是高分辨质谱法检测五味子中木脂素类化合物，以此评估不同地区五味子的产品质量。

2003年国际分析化学年会上，一种新的检测蔬菜与水果农药残留的分析法被科研工作人员提出，并命名为QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）法，该方法操作原理是样品依次加入乙腈与水体积比为70∶30作提取剂，硫酸镁和氯化钠（质量比4∶1）为有机相与水相分散剂，C18、石墨化碳、阴阳离子交换剂等杂质吸附剂，均质、搅拌与离心，从而提取纯化样品，进行仪器检测分析[18]。目前，广泛应用于蔬菜和水果农药残留检测领域[19-20]。近年来也有文献报道将QuEChERS法类比用于其他天然有机物提取前处理领域，比如大豆异黄酮类样品[21-23]。本研究利用HPLC-串联三重四极杆飞行时间质谱（high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry，HPLC-Q-TOF-MS）技术结合QuEChERS前处理方法分析五味子中五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲的含量，同时通过数据依存获取高分辨质谱（information dependent acquisition-mass spectrometry，IDA-MS）技术评估南北五味子质量的差异。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

五味子样品购于百姓中药批发公司、东北长白山特色食品公司（淘宝网）。

3 种五味子标准品：五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲 德国Dr Ehrestorfer公司；乙腈、甲醇（均为色谱纯） 美国赛默飞世尔科技公司；甲酸（色谱纯） 上海阿拉丁试剂公司；硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠（均为分析纯） 广州化学试剂厂；吸附剂C18填料（100～200 目） 德国CNW公司；石墨化碳吸附剂填料 美国西格玛试剂公司；所有用水均为纯水机制备的超纯水（电导率18.2MΩ·cm）。

分别配制五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲3 种五味子质量浓度为1.0 mg/mL的标准储备液，根据需要配制成系列质量浓度的混合标准工作溶液。

1.2 仪器与设备

Triple TOFR5600＋高分辨质谱仪 美国ABsciex公司；HPLC 20AD HPLC仪 日本岛津公司；Xbridge BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，3 µm） 美国Waters公司；Turbo Vap®LV氮吹浓缩仪 瑞典Biotage公司；T25高速均质机、VORTEX 4旋涡混匀器 德国IKA公司；4k-15离心机 美国Sigma公司；Milli-Q超纯水装置 美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Xbridge C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，3 µm）；进样体积：5 µL；流速：0.5 mL/min； 柱温：40 ℃；梯度洗脱：流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱条件：初始30% B相5 min升至80%，1 min升至100%，保留1 min，0.5 min降至30%，保留2.5 min。

1.3.2 质谱条件

离子源：电喷雾电离和大气压化学电离复合源；正离子扫描方式；大气压化学离子源连接动校正系统，每10 个样品自动校正1 次，大气压化学离子源利血平混合液正离子校正液流速0.3 mL/min，气帘气压力：40 psi，雾化气压力：50 psi，辅助气压力：50 psi，离子源温度：500 ℃，离子源电压：5 500 V。一级TOF-MS扫描准确质量范围：100～1 000 Da，数据采集时间100 ms， 去簇电压：100 V，碰撞电压：10 V；二级IDA-MS扫描准确质量范围：50～1 000 Da，去簇电压：100 V，碰撞电压：（35±15）V；高灵敏模式，数据采集时间50 ms，信号阈值100 cps，IDA实验每循环采集6 次数据，动态背景减法扣除。

1.3.3 样品前处理

准确称量1.000 g五味子原料，加入20 mL的70%乙腈溶液，1.0 g硫酸镁和0.25 g氯化钠，80 mg C18吸附剂，振荡1 min，超声振荡15 min，涡旋、离心，转移上清液至25 mL刻度管，加入纯净水定容，取1 mL溶液过0.22 µm滤膜，稀释10 倍或100 倍上机测试。

1.4 数据分析

高分辨质谱数据在ABSciex公司的Analyst TF 1.6软件采集，质谱数据在PeakView 2.0，MasterView 2.0和MultiQuant 3.0等软件上定性定量处理分析。

2 结果与分析

2.1 五味子定性、定量分析依据

本研究选择五味子中木脂类化合物五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素目标分析对照参考物质。首先将3 个目标化合物进行HPLC-Q-TOF-MS分析，获得目标化合物高分辨质谱数据信息；根据一级TOF-MS和二级IDA-MS信息，结合HPLC留时间定性定量分析目标化合物。3 个五味子木脂素类化合物的定性定量分析质谱数据依据见表1。根据目标化合物的准确分子离子峰、同位素峰、准确二级碎片峰以及液相保留时间，可以进行检测分析五味子样品中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的含量。

表1 3 种五味子木脂素化合物高分辨质谱数据Table 1 Mass spectral data of individual lignanoids analyzed by IDA-MS

2.2 定量分析校准曲线、检测限与定量限测定结果

样品中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的含量，根据目标化合物的一级TOF-MS高分辨质谱信息进行分析。首先利用HPLC-Q-TOF-MS分析方法获得目标化合物的离子流色谱（图1），3 种目标化合物配制成混合标准溶液，稀释成一系列质量浓度，获得目标化合物的校正曲线，以及线性范围；同时以3 倍信噪比和10 倍信噪比依据，确定方法的检测限与定量限（表2）。结果表明，校准曲线的R2在0.999 6以上，检测限为0.3～1.5 µg/L，定量限为1～5 µg/L。

图1 五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素离子流色谱图Fig. 1 Extracted ion chromatograms of three lignanoid standards

表2 五味子木脂素类校准曲线、检测限与定量限Table 2 Calibration curves, coefficients of determination, LODs and LOQs for lignanoids

2.3 五味子前处理方法的优化

采用QuEChERS前处理方法提取样品中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素。分别选择硫酸镁与氯化钠（方案1），硫酸镁、氯化钠与柠檬酸钠（方案2），硫酸镁、氯化钠与C18吸附剂（方案3），硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠与C18吸附剂（方案4）4 种方案优化五味子木脂素类化合物的提取条件，结果见图2。

图2 不同萃取条件下五味子木脂素化合物的含量Fig. 2 Lignanoids contents determined using different extraction conditions

图2 显示：4 种前处理萃取条件差异不显著，方案3硫酸镁、氯化钠与C18吸附剂提取样品时，五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的含量较好。为此，以下实验均选择硫酸镁、氯化钠与C18吸附剂的QuEChERS前处理方法提取五味子样品中五味子木脂素类化合物。

2.4 回收率实验结果

为了进一步验证QuEChERS前处理方法与HPLC-Q-TOF-MS检测五味子中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的含量分析方法，实验选择100 µg/L和200 µg/L两个水平（表3）。结果显示，加标回收率在110.6%～115.3%之间，表明本方法可以用于五味子中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素含量的检测。

表3 回收率实验结果Table 3 Recoveries of deoschisandrin, schisandrin and schisandrin B from spiked sample

2.5 实际样品测定结果

5 个样品的五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素含量的测定结果见表4。结果显示北五味子中五味子醇甲和五味子乙素含量比较高，分别在1.72～2.22 mg/g和1.00～1.31 mg/g之间，而南五味子中五味子醇甲和五味子乙素含量在0.2 mg/g以下。南五味子中五味子甲素含量在2.88～3.76 mg/g之间，北五味子含量在0.7 mg/g以下。结果表明南北五味子中木脂素类化合物含量存在显著差异。

表4 实际样品测定结果Table 4 Lignanoids contents of commercial samples

2.6 五味子木脂素化合物的鉴定

表5 五味子木脂素类化合物XIClist[24-30]Table 5 XIClists of lignanoids in S. chinensis

续表5

五味子木脂素类化合物是五味子主要生物活性化合物，为了进一步分析抽查的5 个南北五味子样品的木脂素类化合物的分布情况，研究查阅整理国内外文献报道从五味子植物提取分离到木脂素类化合物[24-30]，建立高分辨质谱XIClist列表（表5），在PeakView软件根据木脂素类化合物的分子结构式与IDA-MS信息，进行结构与质谱数据匹配度分析，在非标准品条件下鉴定样品中木脂素类化合物的分布情况。

图3 样1 IDA-MS筛查离子流色谱图Fig. 3 Extracted ion chromatogram of IDA-MS for sample 1

由图3可知，样1分子式为C23H28O6的木脂素化合物，除了五味子乙素外，还含有戈米辛N与γ-五味子素；分子式为C23H30O6的木脂素化合物为戈米辛K1、K2与K3；分子式为C28H36O8木脂素化合物为巴豆酰戈米辛H和当归酰戈米辛H。

图4 样2 IDA-MS筛查离子流色谱图Fig. 4 Extracted ion chromatogram of IDA-MS for sample 2

由图4可知，样2分子式为C23H28O6的木脂素化合物，除了五味子乙素外，还含有戈米辛N与γ-五味子素；分子式为C23H30O6的木脂素化合物是戈米辛K1、K2与K3；分子式为C28H36O8木脂素化合物是巴豆酰戈米辛H和当归酰戈米辛H。

图5 样3 IDA-MS筛查离子流色谱图Fig. 5 Extracted ion chromatogram of IDA-MS for sample 3

由图5可知，样3分子式为C23H28O6的木脂素化合物，除了五味子乙素外，还含有戈米辛N与γ-五味子素；分子式为C28H34O9的木脂素化合物是巴豆酰戈米辛P和当归酰戈米辛P；分子式为C23H38O7木脂素化合物是戈米辛A。

图6 样4 IDA-MS质谱筛查离子流色谱图Fig. 6 Extracted ion chromatogram of IDA-MS for sample 4

由图6可知，样4分子式为C23H28O6的木脂素化合物，除了五味子乙素外，还含有戈米辛N、γ-五味子素以及其他未知化合物；分子式为C22H24O7化合物是戈米辛N及其同分异构的木脂素类化合物，分子式为C28H34O9的木脂素化合物为巴豆酰戈米辛P和当归酰戈米辛P以及其他同分异构体化合物；分子式为C28H36O8木脂素化合物是巴豆酰戈米辛H与当归酰戈米辛H两个化合物其中一个。

图7 样5 IDA-MS筛查离子流色谱图Fig. 7 Extracted ion chromatogram of IDA-MS for sample 5

由图7可知，样5分子式为C23H28O6的木脂素化合物，除了五味子乙素外，还含有戈米辛N、γ-五味子素以及其他未知化合物；分子式为C22H24O7化合物是戈米辛N及其同分异构的木脂素类化合物，分子式为C28H34O9的木脂素化合物为巴豆酰戈米辛P和当归酰戈米辛P以及其他同分异构体化合物；分子式为C28H36O8木脂素化合物是巴豆酰戈米辛H与当归酰戈米辛H两个化合物其中一个。

对比分析图3～7发现，3 个北五味子中样1和样2离子流指纹色谱图相似，样3北五味子的木脂素成分与样1和样2存在一定差异性；样4与样5两个南五味子的离子流指纹色谱图相似。综上所述可以通过IDA-MS筛查保健食品中功效成分的特征化合物的差异，判断保健食品产品的质量优劣。

2.7 方法对比优势

早期文献报道[14-15]五味子HPLC-质谱图谱鉴定分析评估五味子产品的品质，需要标准品或对照品，以及液相色谱分离条件，进行样品的鉴定分析，本实验研究开发QuEChERS结合HPLC-Q-TOF-MS检测五味子中木脂素化合物的分析方法，可以在非标准品或对照品，以及复杂样品基质条件下，通过提过提取木脂素类化合物的高分辨质谱离子流色谱图，利用49 种木脂素化合物结构式与IDA-MS的匹配关系，鉴定样品中木脂素成分。准确快速地筛查鉴定样品中木脂素化合物及其产地来源。

3 结 论

以五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素3 个五味子木脂素化合物为目标物，优化QuEChERS前处理技术提取五味子中木脂素最佳萃取净化条件，开发了HPLC-Q-TOF-MS检测五味子中木脂素的分析方法。与HPLC及液相色谱-质谱等分析方法相比，该方法在液相色谱分离度低、复杂样品基质以及无标准品条件下，可根据一级TOF-MS和二级IDA-MS信息，实现五味子中木脂素化合物的分析与鉴定；同时根据IDA-MS信息鉴别样品中木脂素化合物分布情况，从而鉴定五味子产品的品质。由此可见，QuEChERS与HPLC-Q-TOF-MS分析方法快速筛查五味子中木脂素成分的选择性好、灵敏度高、准确性高；将该方法用于5 个五味子样品的鉴定，明显筛查鉴别出南五味子与北五味子的差异。

参考文献：

[1] 王越. 五味子化学成分的研究[D]. 长春: 吉林大学, 2015: 1-10.

[2] 王慧清. 南北五味子化学成分研究[D]. 大连: 辽宁师范大学, 2009:1-5.

[3] 高雁, 李廷利. 五味子有效成分的药理作用研究进展[J]. 中医药学报, 2011(6): 104-106.

[4] 王宝莲, 扈金萍, 盛莉, 等. 五味子醇提物的化学-药代-药效指纹图谱研究(英文)[J]. 药学学报, 2013(5): 734-740. DOI:10.16438/j.0513-4870.2013.05.010.

[5] 皮子凤, 侯广月, 艾军, 等. 化学计量学方法研究北五味子中木脂素含量与抗氧化活性的相关性[J]. 中国中药杂志, 2012(8): 1133-1139.DOI:10.4268/cjcmm20120817.

[6] 张延妮, 岳宣峰, 王喆之. 反相高效液相色谱同时测定五味子中五味子醇甲、五味子酯甲和五味子乙素的含量[J]. 分析科学学报,2007(1): 41-44.

[7] 窦志华, 安莉萍, 张琳, 等. HPLC测定五味子种子及果皮中的6 种木脂素类成分[J]. 华西药学杂志, 2016, 31(2): 205-207. DOI:10.13375/j.cnki.wcjps.2016.02.031.

[8] 赵玥, 王冰, 孟雪君. 五味子不同部位5 种木脂素成分含量测定[J].辽宁中医药大学学报, 2010, 12(11): 222-223.

[9] 胡俊扬, 陆兔林, 毛春芹, 等. HPLC法同时测定不同产地五味子中8种木脂素类成分[J]. 中成药, 2012, 34(2): 313-316.

[10] 沈晓君, 刘玉翠, 曲晓波, 等. HPLC法同时测定不同产地五味子中4种木脂素类成分的含量[J]. 中国药房, 2017, 27(3): 387-390.

[11] 贺凤成, 李守信, 赵志全, 等. 一测多评法测定五味子中4 种木脂素类成分的含量[J]. 药学学报, 2012, 47(7): 930-933.

[12] 窦志华, 安莉萍, 陈敏, 等. 一测多评法测定五味子中6 种木脂素类成分的含量[J]. 中国药学杂志, 2014, 49(2): 147-151.

[13] 王丽君, 刘淑敏, 毛春芹, 等. 一测多评法同时测定五味子中6 种木脂素类成分的含量[J]. 药物分析杂志, 2015, 35(7): 1191-1197.

[14] 谭春梅, 黄琴伟, 张文婷, 等. 五味子和南五味子的HPLC指纹图谱研究[J]. 中国现代应用药学, 2008(6): 514-517. DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2008.06.005.

[15] 李晓亮, 易进海, 刘云华, 等. 南五味子、五味子HPLC指纹图谱研究和木脂素成分测定[J]. 中成药, 2011, 33(6): 920-924.

[16] 高文新. 五味子木脂素类成分HPLC、UPLC/Q-TOF-MS分析[D].哈尔滨: 黑龙江中医药大学, 2012: 43-53.

[17] 王宝莲, 扈金萍, 盛莉, 等. 五味子醇提物的化学-药代-药效指纹图谱研究[J]. 药学学报, 2013, 48(5): 734-740.

[18] ANASTASSIADES M, LEHOTAY S J, ŠTAJNBAHER D, et al.Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and “dispersive solid-phase extraction” for the determination of pesticide residues in produce[J]. Journal of AOAC International, 2003, 86(2): 412-431.

[19] WILKOWSKA A, BIZIUK M. Determination of pesticide residues in food matrices using the QuEChERS methodology[J]. Food Chemistry,2011, 125(3): 803-812. DOI:10.1016/j.foodchem.2010.09.094.

[20] NIELL S, JESÚS F, PÉREZ C, et al. QuEChERS adaptability for the analysis of pesticide residues in beehive products seeking the development of an agroecosystem sustainability monitor[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2015, 63(18): 4484-4492.DOI:10.1021/acs.jafc.5b00795.

[21] DELGADO-ZAMARREÑO M M, PÉREZ-MARTÍN L,BUSTAMANTE-RANGEL M, et al. A modified QuEChERS method as sample treatment before the determination of isoflavones in foods by ultra-performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry[J]. Talanta, 2012, 100: 320-328. DOI:10.1016/j.talanta.2012.07070.

[22] BUSTAMANTE-RANGEL M, DELGADO-ZAMARREÑO M M,PÉREZ-MARTÍN L, et al. QuEChERS method for the extraction of isoflavones from soy-based foods before determination by capillary electrophoresis-electrospray ionization-mass spectrometry[J].Microchemical Journal, 2013, 108: 203-209. DOI:10.1016/j.microc.2012.10.023.

[23] BUSTAMANTE-RANGEL M, PÉREZ-MARTÍN L, DELGADOZAMARREÑO M M. Comparative study of the methodology used in the extraction of isoflavones from legumes applying a modified QuEChERS approach[J]. Phytochemical Analysis, 2014, 25(2): 170-177. DOI:10.1002/pca.2487.

[24] HE X G, LIAN L Z, LIN L Z. Analysis of lignan constituents from Schisandra chinensis by liquid chromatography-electrospray mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 1997, 757(1): 81-87.DOI:10.1016/S0021-9673(96)00685-1.

[25] HANCKE J L, BURGOS R A, AHUMADA F. Schisandra chinensis(Turcz.) Baill[J]. Fitoterapia, 1999, 70(5): 451-471. DOI:10.1016/S0367-326X(99)00102-1.

[26] AVULA B, CHOI Y W, SRINIVAS P V, et al. Quantitative determination of lignan constituents from Schisandra chinensis by liquid chromatography[J]. Chromatographia, 2005, 61(9): 515-518.

[27] HUANG X, SONG F, LIU Z, et al. Studies on lignan constituents from Schisandra chinensis (Turcz.) Baill. Fruits using high-performance liquid chromatography/electrospray ionization multiple-stage tandem mass spectrometry[J]. Journal of Mass Spectrometry, 2007, 42(9):1148-1161. DOI:10.1002/jms.1246.

[28] SOVOVÁ H, OPLETAL L, BÁRTLOVÁ M, et al. Supercritical fluid extraction of lignans and cinnamic acid from Schisandra chinensis[J].The Journal of Supercritical Fluids, 2007, 42(1): 88-95. DOI:10.1016/j.supflu.2007.01.008.

[29] PANOSSIAN A, WIKMAN G. Pharmacology of Schisandra chinensis Bail.: an overview of russian research and uses in medicine[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2008, 118(2): 183-212.

[30] LU Y, CHEN D F. Analysis of Schisandra chinensis and Schisandra sphenanthera[J]. Journal of Chromatography A, 2009, 1216(11): 1980-1990.DOI:10.1016/j.chroma.2008.09.070.