慢速冷冻法、玻璃化冷冻法保存小鼠卵巢组织的效果对比观察

李微，张娜，张聪，刘月平，任曙光

(河北医科大学第四医院，石家庄050011)

放疗及化疗是卵巢癌患者的主要治疗手段，但其对卵巢组织可造成严重的不可逆损伤，常导致卵巢早衰[1]。冻存卵巢组织为年轻女性肿瘤及血液病患者保存生育力的一种方式[2～4]，但卵巢组织经过冷冻后血管会出现一定程度的损伤，但血管损伤的机制尚不清楚。研究发现，血管生成素2(Ang-2)及其受体酪氨酸激酶受体2(Tie-2)在发育的卵泡中均有表达，二者与卵泡的发育、闭锁相关，对各级卵泡的发育均会产生影响[5,6]。2016年5月～2017年4月，我们分别应用慢速冷冻法及玻璃化冷冻法对小鼠卵巢组织进行冷冻，比较解冻后两组卵泡正常率及卵巢组织Ang-2、Tie-2表达，现分析结果，以期寻找更适合冻存卵巢组织的方法。

1　材料与方法

1.1材料SPF级8周龄健康BALB/C雌鼠60只，体质量17～20 g，购自河北医科大学动物实验中心，动物许可证号：SCXK(冀)2013-1-003。鼠抗人Ang-2多克隆抗体购自上海Abcam贸易有限公司，鼠抗人Tie-2单克隆抗体和免疫组织化学试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2动物分组及处理将小鼠随机均分为慢速冷冻组、玻璃化冷冻组各30只。两组均给予2%戊巴比妥钠(2 mL/kg)腹腔注射麻醉，手术切除双侧完整卵巢，去除周围结缔组织，将卵巢组织切成2 mm×2 mm×2 mm的小块。慢速冷冻组冷冻及解冻方法：冷冻过程参考Mikkel等[7]的方法，冷冻液和解冻液均采用含10%白蛋白的PBS为基础液。放入预先加入1 mL冷冻保护液(含1.5 mol/L乙二醇、0.1 mol/L蔗糖)的1.8 mL冷冻瓶中，4 ℃平衡25 min；放入慢速冷冻仪中，从4 ℃开始以2 ℃/min降至-9 ℃；植冰，保持10 min，以0.3 ℃/min降至-40 ℃，再以10 ℃/min降至-140 ℃，然后直接投入液氮中。冷冻21天结束时，从液氮中迅速将卵巢组织取出放入37 ℃水浴锅中直至呈液体状(60～90 s)，再分别放入解冻液(含0.75 mol/L乙二醇、0.25 mol/L蔗糖)中10 min、稀释液(0.5 mol/L蔗糖)中10 min、基础液中10 min。玻璃化冷冻组冷冻及解冻方法：冷冻过程参考汪翔等[8]的方法，冷冻液和解冻液均采用含10%白蛋白的PBS基础液。在室温条件下将卵巢放入冷冻液(含7.5%乙二醇、7.5%二甲基亚砜)中25 min，然后放入玻璃化液(含15%乙二醇、15%二甲基亚砜、0.5 mol/L蔗糖)中15 min(包括装入载杆)，然后直接投入液氮中。每根冷冻载杆放2块卵巢组织。冷冻21天结束时，从液氮中迅速将载杆取出放入37 ℃解冻液(含1 mol/L蔗糖)中3 min，然后放入稀释液(含0.5 mol/L蔗糖)中5 min、基础液中5 min。

1.3卵巢组织病理学观察将卵巢组织放入4%甲醛中固定24 h，常规切片后行HE染色，于光镜(400倍)下观察卵巢组织，根据Gougeon[9]标准判定各级卵泡：始基卵泡：单层扁平或扁平与立方混合的前颗粒细胞包绕初级卵母细胞；初级卵泡：单层立方型颗粒细胞包绕卵母细胞；次级卵泡：≥2层的立方型颗粒细胞包绕卵母细胞。正常卵泡呈圆形，颗粒细胞分布均匀，基底膜完整。异常卵泡可表现为结构不完整或消失，颗粒细胞排列不规则、部分脱落，部分可见卵母细胞核固缩或皱缩[10]。比较两组各级卵泡正常率。

1.4卵巢组织Ang-2和Tie-2表达检测采用免疫组化法。Ang-2工作浓度为1∶250，Tie-2为1∶100。Tie-2与Tie-2阳性对照标本为脾脏正常组织，阴性对照用PBS缓冲液代替一抗。Ang-2阳性表达为细胞质内有棕褐色颗粒，Tie-2阳性表达为细胞质内有棕黄色颗粒，染色均高于背景。Ang-2和Tie-2计数采用半定量分析方法，400倍高倍视野下随机取5个视野，计数颗粒细胞、卵泡膜细胞阳性细胞数占全部细胞的比例。判定标准[11]：-为阳性细胞数<10%；+为阳性细胞数10%～30%；++为阳性细胞数<30%～66%；+++为阳性细胞数>66%。+、++、+++均记为阳性。

1.5统计学方法采用SPSS21.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验或秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组各级卵泡情况比较慢速冷冻组始基卵泡正常率高于玻璃化冷冻组(P<0.05)，初级卵泡、次级卵泡正常率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1　两组卵巢组织中各级卵泡情况[个(%)]

2.2两组卵巢组织Ang-2、Tie-2表达比较两组卵泡膜细胞Ang-2、Tie-2阳性表达率均<30%，因此只有-和+两种表达情况。两组颗粒细胞冷冻前Ang-2(+++)、Tie-2(+++)阳性表达率均高于冷冻后，慢速冷冻组解冻后颗粒细胞Ang-2(+++)、Tie-2(+++)阳性表达率均高于玻璃化冷冻组；两组卵泡膜细胞冷冻前Ang-2、Tie-2阳性表达率均高于冷冻后，慢速冷冻组解冻后卵泡膜细胞Ang-2、Tie-2阳性表达率均高于玻璃化冷冻组；组间及组内比较P均<0.05。见表2～4。

表2　　　　两组卵巢组织冷冻前后颗粒细胞Ang-2、Tie-2表达情况(例)

注：与同组冷冻前比较，*P<0.05；与玻璃化冷冻组同时间点比较，#P<0.05。

表3　　　　两组卵巢组织冷冻前后卵泡膜细胞Ang-2、Tie-2表达情况(例)

注：与同组冷冻前比较，*P<0.05；与玻璃化冷冻组同时间点比较，#P<0.05。

表4　两组卵巢组织颗粒细胞、卵泡膜细胞中Ang-2、Tie-2表达阳性率比较(%)

注：与同组冷冻前比较，*P<0.05；与玻璃化冷冻组同时间点比较，#P<0.05。

3　讨论

卵泡的发育过程为始基卵泡-初级卵泡-次级卵泡-窦前卵泡-窦腔卵泡，而始基卵泡是雌性动物的基本生殖单位，是整个生殖期中各级卵泡及卵子发育的源头，也是雌性动物生殖功能的储存池。因此，卵巢冷冻过程中始基卵泡保护得当是冷冻成功的关键。慢速程序化冷冻法和玻璃化冷冻法均为目前常用的卵巢组织冷冻方法。慢速程序化冷冻采用低浓度的冷冻保护剂，从而降低细胞毒性；但冷冻过程易产生细胞内冰晶，容易造成细胞损伤，且步骤繁琐，耗时较长，所需设备昂贵。玻璃化冷冻是一种快速的方法，使细胞内外液态直接转化为非晶体的玻璃化态，此过程可减少细胞内外冰晶的形成，且不需要使用特殊的设备，节省时间和成本；缺点是需使用高浓度的冷冻保护剂，对细胞毒性较大。玻璃化冷冻法在冷冻卵母细胞、胚胎方面取得了一定的进展。但目前尚无统一的玻璃化冷冻保存体系，因此该方法对冷冻卵巢组织的效果并不稳定，哪一种方法更适于冻存卵巢组织目前也尚无定论。

Ang-2主要由血管内皮细胞分泌，在血管内皮细胞中与内皮细胞特异性受体Tie-2结合，使内皮细胞之间及内皮细胞与支持细胞之间出现解离，降低血管稳定性，使血管弹性增大，促进血管重构[12,13]。Tie-2磷酸化参与血管生成的延续过程，使血管成熟稳定[14]。有学者通过对成年动物生殖系统研究发现，Ang-2仅表达在血管形成活跃的组织中，如卵巢、子宫、胎盘等[15]。Nishigaki等[16]亦发现，Ang-2与Tie-2在卵巢组织中表达，与血管生成相关。

本研究结果显示，慢速程序化冷冻法和玻璃化冷冻法均会对卵巢组织产生一定的损伤。损伤表现在两个方面：一是Ang-2和Tie-2表达变化，二是各级卵泡形态学改变。本实验中窦前卵泡及窦腔卵泡数量太少，因此未进行统计。解冻后两组颗粒细胞及卵泡膜细胞中Ang-2和Tie-2表达均弱于冷冻前，且慢速冷冻法对Ang-2及其受体的损伤程度要小于玻璃化冷冻法。但Choi等[17]采用两种方法冷冻裸鼠卵巢组织，发现其对卵巢组织Ang-2表达的影响无明显差异。结果产生差异的原因可能与研究对象、实验条件等不同有关。本研究两组颗粒细胞Ang-2和Tie-2表达阳性率均高于卵泡膜细胞，说明Ang-2和Tie-2与卵泡的发育密切相关。Fabbri等[18]认为，由于始基卵泡体积较小、缺乏卵泡液、无透明带，冷冻保护剂更容易进入细胞内，冷冻对其损伤较小。由于初级卵泡及次级卵泡体积增大、细胞液增多，因此冷冻对其损伤较大。本研究同样发现，两组解冻后始基卵泡正常率最高，均高于50%，而初级卵泡和次级卵泡的正常率均不足40%，说明始基卵泡更易耐受冷冻；慢速冷冻的始基卵泡正常率明显高于玻璃化冷冻，说明慢速冷冻方法在保护卵泡方面要优于玻璃化冷冻法，与Oktay等[19]研究结果相同。Ting等[20]研究发现，慢速冷冻组初级卵泡的正常率与玻璃化冷冻组相比差异无统计学意义，与本实验结果相符；玻璃化冷冻组次级卵泡正常率高于慢速冷冻组，与本实验结果不同，可能是由于不同实验室有不同的冷冻操作有关。

本研究中无论是在Ang-2、Tie-2，还是在卵泡结构损伤方面，慢速冷冻的损伤均小于玻璃化冷冻。分析原因有以下几点：①慢速冷冻为程序化冷冻，大部分步骤在冷冻仪内进行，时间固定，客观性强，误差较小；玻璃化冷冻人为因素较多，每一次的操作不能保证完全相同。②慢速冷冻的低浓度保护剂对细胞损伤较小，玻璃化冷冻高浓度的保护剂对细胞产生较大毒性和渗透性损伤。③玻璃化冷冻速度较快，有可能造成冷冻保护剂渗透不充分，未能起到完全的保护作用。

综上所述，慢速冷冻法、玻璃化冷冻法保存卵巢组织均会损伤卵巢组织内各级卵泡，并导致Ang-2、Tie-2表达变化；但慢速冷冻法对卵巢组织的损伤相对较小。

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