miR-1表达变化对食管鳞癌细胞增殖、凋亡及侵袭成瘤能力的影响

程秀莲 ，刘琨

(张家口市第一医院，河北张家口075000)

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤[1,2]，其中我国某些地区的发病率和病死率居世界之首，如河南林县地区等[3]。食管癌的病理类型根据地域不同也呈现明显的集中趋势，在亚洲国家如中国和日本，食管癌的主要类型是鳞状细胞癌(ESCC)，欧美国家则主要是腺癌(EAC)[4]。因此ESCC这一我国多发的食管癌类型值得深入研究。导致食管癌病死率高的原因是肿瘤细胞的侵袭增殖能力强和早期即出现转移，因此阐明食管癌恶性表型发生发展的分子机制，对于食管癌的防治具有重要意义。miRNA是内源性非编码小分子RNA，主要通过结合下游靶基因来调节基因的表达[5]。最近研究[6]表明，miRNA参与食管癌的恶性转归，提示其与食管癌的发生密切相关。miR-1对肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力调控的分子机制多样，在不同器官组织之间差异更为明显。本研究观察了miR-1表达变化对食管鳞癌细胞增殖、凋亡及侵袭、成瘤能力的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 食管鳞癌细胞株TE1、TE-13、EC9706、Kyse70、Kyse140、Kyse150、Kyse450和正常食管上皮细胞株Het-1A均来自我院生物实验室。鼠龄6～8周的Balb/c雄性裸鼠14只。TRIzol，PrimeScript RT reagent Kit，SYBR Premix Ex Taq real time PCR kit，PCR引物(生工生物工程有限公司合成)，Lipofectamine2000转染试剂盒，大肠杆菌菌株DH5α，293T细胞株，限制性内切酶，T4连接酶，CCK-8试剂，Transwell 小室，细胞凋亡检测试剂盒。

1.2 miR-1表达变化对食管鳞癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭能力的影响观察

1.2.1 食管鳞癌细胞分组及miR-1转染方法 采用real-time PCR法检测食管正常上皮细胞Het-1A和7个食管鳞癌细胞株ECA109、KYSE140、TE1、KYSE150、ECA9706、TE13、KYSE450中的miR-1，以U6作为内参，结果显示在各食管鳞癌细胞株中miR-1相对表达量均低于食管正常上皮细胞，其中miR-1在KYSE450中表达量较高，在KYSE150表达量较低，所以选取KYSE450、KYSE150细胞做进一步实验。将KYSE150细胞分为过表达组、抑制组和对照组。过表达组细胞转染pHBLV-miR-1慢病毒，抑制组转染miR-1抑制剂，对照组不做特殊处理。采用qRT-PCR法检测各组细胞中的miR-1，过表达组、抑制组、对照组中miR-1相对表达量分别为412.25±11.22、0.32±0.11、1.00±0.01，过表达组miR-1相对表达量显著高于抑制组、对照组，抑制组miR-1相对表达量显著低于对照组。

1.2.2 细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。将三组细胞接种于96孔板中，每孔1 500～2 000个细胞，每孔加100 μL的培养基，分别于培养0、24、48、72 h时每孔加入10 μL的CCK-8试剂，37 ℃孵育2～4 h后用酶标仪检测450 nm波长光密度值(OD值)，表示细胞增殖能力。

1.2.3 细胞凋亡率测算 将KYSE150接种于6孔板，按前述方法进行瞬时转染，细胞转染72小时后收集细胞，消化各组细胞，1 000 r/min离心5 min，收集细胞沉淀。弃上清，用冰箱预冷过的PBS溶液重悬细胞，然后再次1 000 r/min离心5 min，重复步骤1次。用200 μL的Bindingburfer重悬细胞。加入5 μL的AnllexinⅤ-FITC，轻柔混匀，室温下暗处孵育15 min。加入10 μL的PI，暗处孵育5 min后加入300 μL的Bindingbuffer混匀，上机。ModFit LT软件分析测算细胞凋亡率。实验重复3次。

1.2.4 细胞侵袭能力检测 将KYSE150接种于6孔板，按前述方法进行瞬时转染，细胞转染72 h后收集细胞，按1∶3的比例混合Matrigel和无血清培养基制备成人工基底膜；将滤膜完整的小室放入24孔板中，于上室各加入50 μL上述混合液；每个Transwell小室内接种各组细胞悬液(1×105/100 μL)，并在下室中加入500 μL含10%血清的细胞培养液，37 ℃培养；培养24 h后取出小室，弃去小室内的残余培养液；将小室置于无水乙醇中固定30 min，PE染色；PBS清洗2遍，用棉拭子轻柔擦去小室内表面未能侵袭的细胞，将小室置于新的24孔板中，于倒置相差显微镜下观察小室外表面的细胞并拍照计数；记录5个视野的穿膜细胞数，将5个视野数值相加，获得穿膜细胞数。

1.3 miR-1表达变化对KYSE150细胞成瘤能力的影响观察 将裸鼠分为A、B、C组，每组5只，将3×106/300 μL的KYSE150细胞于双侧腋部皮下注入裸鼠皮下，A组接种转染pHBLV-miR-1的KYSE150细胞，B组接种转染miR-1抑制剂的KYSE150细胞，C组接种不作特殊处理的KYSE150细胞观察各组裸鼠活动、排便、体毛、体重变化；2周后观察裸鼠成瘤情况；分别于第4周末和第6周末处死各组裸鼠，测量肿瘤体积及质量。

2 结果

2.1 各组KYSE150细胞增殖能力比较 培养24、48、72 h后，抑制组、对照组、过表达组KYSE150细胞增殖能力依次减弱(P均<0.05)。详见表1。

表1 各组KYSE150细胞OD值

注：与对照组相比，*P<0.05；与过表达组相比，#P<0.05。

2.2 各组KYSE150细胞凋亡率比较 对照组、过表达组、抑制组细胞凋亡率分别为20%±1%、42%±2%、8%±2%，其中过表达组细胞凋亡率最高，抑制组细胞凋亡率小于对照组(P均<0.05)。

2.3 各组KYSE150细胞侵袭能力比较 对照组、过表达组、抑制组穿膜细胞数分别为53.68±4.26、41.56±3.18、82.34±7.56，其中过表达组穿膜细胞数最少，抑制组穿膜细胞数高于对照组(P均<0.05)。

2.4 各组裸鼠移植瘤体积和质量比较 A、B、C组裸鼠移植瘤体积分别为(1 732.58±89.48)、(482.35±32.16)、(2 431.69±44.48)mm3，肿瘤质量分别为(2 123.66±92.38)、(513.27±38.46)、(3 132.33±49.58)mg，其中B组肿瘤体积和肿瘤质量最小，C组肿瘤体积和肿瘤质量高于A组(P均<0.05)。

3 讨论

食管癌是预后最差的恶性肿瘤之一，早期食管癌经手术及放化疗综合治疗后5年复发率仍然高达30%。大部分(约75%)食管癌患者就诊时已处于中晚期，失去了外科手术的最佳时机，极易复发及远处转移，Ⅰ～Ⅳ期患者总体5年生存率仅约10%[5]。因此，研究食管癌的发病及进展机理，有利于阐明食管癌细胞恶性表型的调控机制[6]，对食管癌的早期诊断、预后评估、延长患者生存期及选择适当的治疗方式都具有极为重要的意义。

miR-1家族包括2个miRNA即miR-1-1和miR-1-2。miR-1-1和miR-1-2是几乎相同的基因，两者均位于相关编码基因的内含子区。其中，位于人20号染色体上C20orf166基因初级转录本第2个内含子区的是miR-1-1，位于人18号染色体上蛋白质编码基因MIB1第12个内含子区的是miR-1-2[7，8]。miR-1-1和miR-1-2不仅仅是构成几乎相同，而且其成熟产物miR-1及两者作用的靶基因也几乎相同[9]。miR-1的正常表达对于维持心脏功能不可或缺[10]，miR-1异常表达可导致相关心血管疾病，如心肌发育不良、室中隔缺损、心率失常等。近年来越来越多的研究表明miR-1在肿瘤发生发展中也起着重要作用，miR-1表达下调是多种肿瘤中最常见的事件之一。在肺癌中，miR-1可逆转肺癌细胞的增殖、迁移等恶性生物学表型，如检测血清miR-1对评估非小细胞肺癌患者预后具有一定的临床价值。

Guo等[11～13]首次报道了食管鳞癌中miRNA的表达谱，采用miRNA芯片技术发现了在食管鳞癌和癌旁正常组织中表达差异很大的7种miRNA，其中hsa-miR-103/107与食管鳞癌患者预后明显相关。食管鳞癌的发生发展是一个多步骤、多水平、多基因参与的复杂性生物学过程。miRNA可能在多个维度都参与了食管鳞癌的恶性转归，特别是参与了早期食管鳞癌的发生过程[14～17]。miRNA可能通过调节与增殖、周期、凋亡、迁移、侵袭和耐药性等相关的信号转导通路功能而影响食管鳞癌的恶性表型[18～20]。

本研究观察了miR-1表达变化对食管鳞癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响，结果显示培养24、48、72 h后，抑制组、对照组、过表达组KYSE150细胞增殖能力依次减弱；过表达组细胞凋亡率最高，抑制组细胞凋亡率小于对照组；过表达组迁移细胞数最少，抑制组迁移细胞数高于对照组。这提示miR-1过表达可抑制食管鳞癌细胞的增殖、侵袭能力并促进细胞凋亡，而干扰miR-1则起到相反的作用，提示miR-1在食管鳞癌发生发展中可能扮演着抑癌基因的角色。为了进一步观察miR-1在体内对食管鳞癌的生物学功能，我们构建了分别将过表达、低表达miR-1的食管鳞癌细胞接种于裸鼠皮下，结果显示B组裸鼠移植瘤体积和质量最小，C组肿瘤体积和肿瘤质量高于A组，提示miR-1过表达可抑制食管鳞癌细胞的体外成瘤能力，反之抑制miR-1表达则可增强食管鳞癌细胞的体外成瘤能力。本研究的开展不仅有助于更深入理解食管鳞状细胞癌的发生发展机制，而且可为食管鳞状细胞癌的诊断、预后相关工作提供新的研究基础，并为其治疗提供新的思路和方向。

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