红松松针原料超声波辅助提取生物抑菌剂的研究

武天琦，张欣，张智*，张晓华

(1.东北林业大学，哈尔滨 150040；2.黑龙江省轻工科学研究院，哈尔滨 150010；3.牡丹江市食品药品检测中心)

红松松针是红松(Pinuskoraiensis)的叶。红松松针具有再生速度快、分布范围广、天然储量大、可持续利用的特点[1]。松针利用历史悠久，《本草纲目》记载：“松针气味苦、温、无毒，主治风湿痔疮，生毛发、安五脏、守中、不饥荒年”[2]，具有镇静、镇痛、抗炎、解热等临床药理作用[3]和增强免疫力、降血脂、抗衰老、抗疲劳及抗氧化等多种保健功能[4-5]，此外，松针还有较强的的抑菌[6]能力，但研究较少。本文应用响应面方法，采用大肠杆菌抑菌效果为指标，优化了超声波辅助工艺对红松松针抑菌物质提取的条件，为开发红松松针为原料的抑菌剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

红松松针采集于东北林业大学。大肠杆菌为东北林业大学食品微生物实验室保存。

1.2 仪器

中药粉碎机；电热恒温干燥箱；电子分析天平；旋转蒸发仪；pH计；灭菌锅；无菌操作台；恒温振荡器；恒温培养箱；超声波清洗器。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理。将红松松针洗净后，放置于干燥箱中烘干，用中药粉碎机粉碎并过60目筛，用1∶40石油醚浸泡24h脱去粗脂肪，烘干后备用。

1.3.2 抑菌圈的测定。将提取液旋转蒸发去除溶剂后定容至50mL。采用滤纸片扩散法测定抑菌圈的大小，向90mm培养皿中倒入20mL已灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，待其凝固后，加入100μL菌液，涂布均匀，静置5min。滤纸片打成直径6mm的圆片，灭菌。将含有10μL提取液的的滤纸片置于培养皿表面。培养皿于37℃培养24h，用游标卡尺测量抑菌圈大小[7]。

1.3.3 抑菌活性单因素试验。抑菌活性测定单因素试验包括乙醇浓度、料液比、超声时间、提取温度，乙醇浓度(A)：40%、50%、60%、70%、80%，料液比(B)：20、30、40、50、60mL/g，超声时间(C)：10、20、30、40、50min，提取温度(D)：30、40、50、60、70℃。每个因素进行3次重复试验，选用平均值作为参数，确定各因素对结果的影响。

表1 红松松针提取物对大肠杆菌抑菌活性单因素试验表

1.3.4 抑菌活性响应面试验。在单因素试验的基础上，根据Design-Expert 8.0软件，Box-Behnken设计响应面试验，并用SAS9.0统计分析软件对4因素3水平的响应面结果进行分析。试验因素水平见表2。

表2 响应面试验因素与水平

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对抑菌效果的影响。由图1可知，提取液中乙醇含量从40%逐渐增加时，析出的松针抑菌物质量也逐渐增多，抑菌圈直径显示出增大现象；而乙醇浓度为50%是一个临界条件，再继续增大，抑菌圈直径降低。

图1 乙醇浓度对松针抑菌物质提取的影响

2.1.2 料液比对抑菌效果的影响。由图2可知，料液比依次增大，抑菌圈直径先增大最后平稳略下降。横坐标的料液比为50mL/g时，纵坐标的抑菌圈直径最大，为9.12mm。当料液比达到50mL/g时，松针抑菌物溶出量达到顶峰，不再溶出，抑菌圈直径呈现平稳状态。

图2 料液比对松针抑菌物质提取的影响

2.1.3 超声时间对抑菌效果的影响。由图3可知，超声时间增加，抑菌圈直径先增大后减小。当为30min时，抑菌圈直径最大，为9.24mm。

图3 超声时间对松针抑菌物质提取的影响

2.1.4 提取温度对抑菌效果的影响。由图4可知，提取温度增加，抑菌圈直径先增大后减小。当为50℃时，抑菌圈直径最大，为9.11mm。提取温度50℃是一个临界条件。

图4 提取温度对松针抑菌物质提取的影响

2.2 响应面试验

表3 响应面设计及试验结果

根据表2安排试验，对试验结果回归拟合所得回归模型如下：y=9.75+0.065×A+0.32×B+0.24×C+0.16×D-0.048×A+0.088×A×C+0.056×A×D+0.14×B×C+0.097×B×D-0.057×C×D-0.58×A2-0.30×B2-0.72×C2-0.64×D2

由表3、4可知，失拟项P=0.6317>0.05，表明模型与实际值之间具有较好的拟合度；模型的P<0.0001,说明模型具有极高的显著度；模型的决定系数R2=0.9032，AdjR2=0.8129，说明预测值与实测值之间具有较好的拟合度，表明模型的可靠性高。

表4 响应面二次模型方差分析

由图5可知，影响红松松针抑菌物对大肠杆菌抑菌效果的因素顺序为：B>C>D>A，即影响最大的是料液比，其次是提取时间。此回归模型的最优结果为乙醇浓度50.55%，料液比56.05mL/g，超声时间32.19min,提取温度51.60℃，在此条件下对应的响应值R的最大值为9.89mm，即最大的抑菌圈直径为9.89mm。考虑仪器设备及相关条件，确定最优工艺参数值为乙醇浓度50%，料液比56mL/g，超声时间30min,提取温度50℃，在此工艺条件进行3次平行试验，得到的抑菌圈大小为(9.78±0.14)mm。

3 结果与讨论

本试验研究超声波辅助对红松松针抑菌物进行提取，运用了滤纸片法测定大肠杆菌抑菌圈大小作为研究指标，并用响应面法进行了优化。经过综合考虑后最佳工艺条件为乙醇浓度50%，料液比56mL/g，超声时间30min,提取温度50℃。试验结果表明，适宜提取条件下，红松松针抑菌物对大肠杆菌具有良好的抑菌活性，其作为植物源抑菌剂可能具有良好的开发前景，但其抑菌活性成分还有待进一步的研究。

图5 两因素交互作用对红松松针抑菌物质提取效果影响的响应面图

[1]12 MEI J，CHEN P，PENG P.PCDD/Fs accumulation in pine needles:variation with species and pine needle age[J].Environmental Science & Pollution Research，2016，23(01):563-570.

[2]李时珍.本草纲目(下册)[M].北京：人民卫生出版社，1982:1917.

[3]李萍，刘友平.松针研究进展[J].成都中医药大学学报，2001，24(03):49-50.

[4]YOU-LAN H E，LIU A Q，TIGABU M，et al.Physiological responses of needles of Pinus massoniana elite families to phosphorus stress in acid soil[J].林业研究(英文版) ，2013，24(02):325-332.

[5]WANG J Y，SHU L I，YANG X F，et al.Resistance Activities to Pathogenic Bacteria and Composition Analysis of Cedrus deodara Needle Extracts[J].Lishizhen Medicine & Materia Medica Research，2015.

[6]黄顺东.松针临床应用及药理研究概况[J].实用中医药杂志，2005，21(08):514-515.

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