高效液相色谱法测定苜蓿中脱落酸的含量

(北京市理化分析测试中心，有机材料检测技术与质量评价北京市重点实验室，北京市科学技术研究院分析测试技术重点实验室，北京 100094)

苜蓿(Medicagosativa)为多年生豆科草本植物，是世界上广泛种植的豆科牧草之一，主要分布于地中海区域、非洲、西南亚和中亚地区。苜蓿因其高产、营养丰富且具有根瘤固氮[1,2]等优点，而被广泛种植，被誉为“牧草之王”[3]。ABA是最早在对植物芽和种子休眠研究过程中发现的物质，其可作为植物抗旱能力重要的调节因子，ABA对于植物的细胞分裂与伸长、组织与器官分化、休眠与萌发、植物形态建成以及离体组织培养等方面具有重要作用[4,5]。通过分析ABA在植物体内分布的含量变化规律，研究其与抗逆能力的关系，将为合理、有效地配比外源激素，提高植物的抗逆性、培育出耐旱植物的新品种提供有力的理论依据[6]。因此建立快速准确的苜蓿中ABA的分析方法具有重要的应用意义和实用价值。

对于ABA的分析目前多采用生物鉴定法，免疫学方法，以及物理化学方法[7,8]。其中化学方法中的色谱法因其具有检测方法专一，灵敏和准确高的特点，已成为植物激素检测中常用的技术[9-11]。本实验选取苜蓿根系样品为研究对象，通过样品前处理方法优化，HPLC分析方法学考察，建立了高效液相色谱测定苜蓿中脱落酸含量的方法，该方法具有快速、简便、准确的优点，可以应用于植物中ABA含量的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-20A高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)；CR22G Ⅲ离心机(日本Hitachi公司)。

乙腈、石油醚(均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；甲醇(色谱纯，美国Fisher Scientific公司；SPE专用柱管(购买自Agilent公司)；Sep-Pak C18柱(购买自Waters公司)； PVPP、ABA对照品(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 样品前处理方法

1.2.1 提取方法

取苜蓿根系样品，液氮冷冻研磨，采用避光冷浸提取(冰箱4℃)的方法进行提取。分别对提取溶剂、提取时间、料液比、提取次数等条件进行优选，研究不同提取条件对ABA含量的影响，最终确定ABA最佳的提取方法。

1.2.2 净化方法建立

采用自制PVPP柱和Sep-Pak C18柱联用进一步对样品进行处理。首先，称取PVPP0.5g，填入SPE专用柱管，并与活化后的Sep-Pak C18柱串联。加入提取后样品，待样品完全通过PVPP柱和SPE柱，拆下PVPP柱，并对SPE柱进行清洗、洗脱，得到ABA净化后样品。

1.3 分析方法

1.3.1 HPLC色谱条件

色谱柱ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(3.0 mm×150 mm，3.5 μm)；CH3OH∶1%乙酸水溶液=35∶65等度洗脱；检测波长254 nm，进样量20 μL，流速0.4 mL/min，柱温35℃。

1.3.2 线性范围和检出限

称取ABA对照品25 mg置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得1.0 mg/mL ABA对照品溶液。从其中分别吸取5.0、2.5、1.0、0.5 mL置于4个10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，则浓度依次为0.5、0.25、0.1、0.05mg/mL。分别对上述对照品溶液进行HPLC分析，绘制标准曲线。其中，对0.05 mg/mL ABA对照品溶液用逐级稀释的方式获得检出限和定量限，以信噪比(S /N≥3)的检测量为检出限，以信噪比(S/N≥10)的检测量为定量限。

1.3.3 稳定性

取1.0 mg/mL ABA对照品溶液，分别在0、12、24、36、48h进行HPLC分析。测定峰面积积分值，考察ABA溶液的稳定性。

1.3.4 精密度

取1.0 mg/mL ABA对照品溶液，重复进行HPLC分析6次。测定峰面积积分值，考察方法精密度。

1.3.5 重复性

取同一种样品按照1.2优化后的前处理方法平行提取6份，分别进行HPLC分析。测定峰面积积分值，考察方法重复性。

1.3.6 加标回收率

对已知含量的同一样品分别添加3种不同质量浓度的ABA对照品，每个浓度水平样品重复3次，按照1.2优化后的前处理方法进行提取，并进行ABA含量测定，考察加标回收率。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法

2.1.1 提取溶剂

称取液氮研磨后苜蓿根系样品1.0 g，按料液比1∶10 g/mL分别加入冷却的甲醇、乙腈、水、80%甲醇、50%甲醇溶液(以上溶液均内含10 μg/L的抗氧化剂BHT)，放置4℃冰箱提取24 h，浸提液以10000 r/min离心15 min得上清液，于35 ℃减压浓缩至原体积1/3。用1 mol/L Na2HPO4调节至pH=8，加入等体积石油醚萃取脱色3次，弃去石油醚相后，加入0.1 g PVPP，常温下摇床振荡30 min，10000 r/min离心15 min弃去PVPP，滤液用2 mo1/L柠檬酸调节至pH=3，再用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，于35℃减压浓缩至干。所得残留物加入3 mL pH 3.5磷酸盐缓冲液溶解，过Sep-Pak C18预处理小柱进一步纯化ABA(依次为5 mL甲醇清洗，5 mL磷酸盐平衡，3 mL样品上样，5 mL 20%甲醇清洗，5 mL 80%甲醇洗脱)。其中，80%甲醇洗脱液在40 ℃浓缩至干，用流动相溶解至1 mL，溶液经0.45 μm微孔滤膜过滤后，进行HPLC分析。每个样品平行提取3次，结果表明80%甲醇作为提取溶剂时，ABA的提取率最高(表1)。

表1 提取溶剂优化试验

2.1.2 提取时间

80%甲醇作为提取溶剂，设定提取时间分别为4 h、8 h、16 h、24 h，其余条件同2.1.1，结果见表2，当提取时间为16 h和24 h时，ABA的提取率基本相同。故选取提取时间为16 h为单因素最佳条件(表2)。

表2 提取时间优化试验

2.1.3 料液比

80%甲醇作为提取溶剂，提取时间16 h，设定料液比分别为1∶5 g/mL、1∶10 g/mL、1∶20 g/mL、1∶30 g/mL，其余条件同2.1.1，结果见表3。在料液比达到1∶20 g/mL之前，提取率随提取液用量的增加而增加，当料液比继续增大时，提取率基本保持不变。为了减少样品后续减压浓缩的时间，故选取料液比为1∶20 g/mL为单因素最佳条件(表3)。

表3 料液比优化试验

2.1.4 提取次数的确定

选择80%甲醇作为提取溶剂，提取时间16 h，料液比为1∶20 g/mL，提取次数分别为1次、2次、3次，其余条件同2.1.1，结果见表4。随着提取次数增多ABA提取率提高，但提取次数达到3次时提取率呈下降的趋势，一方面可能由于提取次数增多，导致其他杂质的溶出，从而干扰了ABA的提取，另一方面，可能为提取时间过长，导致ABA不稳定降解，故选取提取次数2次为最佳条件。综上，ABA最佳的提取条件为：提取溶剂为80%甲醇，提取时间16 h，料液比为1∶20 g/mL，提取2次(表4)。

表4 提取次数优化试验

2.1.5 净化方法建立

基于PVPP对多酚类杂质吸附的特性和SPE对ABA良好的富集性，建立了PVPP和SPE联用方法。通过在SPE专用柱管中装填PVPP后与Sep-Pak C18柱串联，对提取后样品采用磷酸盐缓冲液溶解后上柱净化，一步完成去除多酚和ABA富集工作，大大缩短了样品的净化时间。

2.2 样品分析方法

2.2.1 线性范围和检出限

以ABA对照品浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y= 226595.4X+1064.4，相关系数为0.9991。结果表明，ABA在0.05～1 mg/L范围内线性关系良好。用逐级稀释的方式获得ABA的检出限和定量限，其中检出限为0.02μg/g和定量限为0.04μg/g，(图1)。

图1 ABA对照品标准曲线

2.2.2 稳定性

通过对不同时间点的ABA对照品溶液进行HPLC分析，测定峰面积积分值。ABA对照品峰面积积分值的RSD为2.40%，结果表明ABA在48 h内稳定性良好。

2.2.3 精密度

通过对ABA对照品溶液重复进行HPLC分析，测定峰面积积分值。ABA对照品峰面积积分值的RSD为0.97%，结果表明该方法精密度良好。

2.2.4 重复性

通过对同一种样品进行平行提取，分别进行HPLC分析，测定峰面积积分值。样品中ABA峰面积积分值的RSD为3.42%，结果表明该方法重复性良好。

2.2.5 加标回收率

加标回收率试验结果见表5。低、中、高3种水平ABA溶液的加标回收率分别是91.7%、93.8%、105.2%，RSD 分别为3.85%、2.94%和2.58%，结果见表5。

表5 ABA回收率试验结果(n=3)

2.3 苜蓿中脱落酸含量测定

采用上述建立的前处理和分析方法，分别对中苜1号、费纳尔、敖汉苜蓿的根系样品开展ABA含量的检测。结果见表6、图2。

表6 苜蓿中脱落酸含量测定

图2 苜蓿中脱落酸含量测定HPLC色谱图A.中苜1号；B.费纳尔；C.敖汉

3 结论

经样品前处理方法优化，确定ABA最佳的提取条件为：提取溶剂80%甲醇(内含10 μg/L的抗氧化剂BHT)，提取时间16 h，料液比为1∶20 g/mL，提取2次。同时，采用自制PVPP柱的方式，建立了PVPP吸附和SPE联用方法，减少了前处理时间。并对HPLC分析方法进行考察，结果显示ABA在0.05～1 mg/L范围内线性关系良好，检出限为0.02μg/g，定量限为0.04μg/g。该方法稳定性、精密度、重现性良好，加标回收率为91.7～105.2%。经实际样品检测，所建立的方法具有快速、简便、准确的优点，可以广泛应用于植物中ABA含量的测定。

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