微孔滤膜在实验室研究与分析检测中的应用

张俊伟，邹凯伦

(杭州安诺过滤器材有限公司，浙江 杭州 311404)

微孔滤膜分离技术是一种压力驱动型膜分离技术，其核心组件是采用高分子有机材料(如聚醚砜，聚四氟乙烯，聚偏二氟乙烯等)或无机材料(陶瓷，玻璃纤维，金属等)制备的微孔滤膜。流体(液体和气体)，在过滤上下游压差力的作用下，经过微孔滤膜的过滤，流体中粒径大于膜孔径(通常为0.03-100 μm)的微粒会被微孔滤膜截留或吸附，下游则得到了较纯净的流体，从而达到了固液分离和固气分离的效果[1]。从世界范围来看，普通如家庭生活、大型如工业生产、高端如科学研究，都在不同程度上应用微孔滤滤膜分离技术。微孔滤膜和以其为核心材料制成的滤器在应用端主要性能表现在以下方面：①截留率；②纳污量；③化学性兼容性；④表面湿润程度；⑤使用温度范围；⑥机械强度；⑦可清洗性；⑧吸附性等。早在二战期间，德国就开始尝试用孔径约0.5μm的微孔滤膜检测城市给水系统中的大肠杆菌。战后，美、英等国深入开展了滤膜技术的研究，并于1947年起各自相继成立了滤膜的工业生产和研究机构，其中包括了一些世界著名的微孔膜和滤器生产型企业，如Merk Millipore，Pall，3M等。近十几年来，随着各类型微孔滤膜和以其为核心材料制成的滤器的研制成功和应用开发，该项类型产品及相关技术不仅在世界各国科研，各工业生产领域和民用领域中得到较广泛的应用，而且也已经应用到实验室研究和分析检测领域中，具体应用点包括了：色谱分析、液体澄清/除菌/除病毒过滤、无菌通气、微生物检测和计数、蛋白和核酸检测、环境空气细颗粒物(PM2.5)监测和医疗诊断试纸等。接下来，本文就微孔滤膜在国内外实验室研究和分析检测领域的应用进行较为详细的综述。

1 微孔滤膜在色谱分析中的应用

微孔滤膜及滤器在化学分析研究中具有十分广泛的应用。分析仪器诸如高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、凝胶色谱(GPC)、离子色谱(IC)以及电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等在制样时均需使用相关微滤产品去除样品中的颗粒杂质，防止管路、泵或分离柱等关键零部件的堵塞或损伤，延长整机的使用寿命的同时并保证分析结果的准确性。

以HPLC为例，其进样前需要使用0.22 μm或0.45 μm的针式过滤器，配合针筒手工推注过滤样品，去除不溶性的颗粒物。HPLC的流动相在使用前也需要用0.22 μm或0.45 μm微孔滤膜配合玻璃抽滤瓶进行真空抽滤去除颗粒，或者也可在HPLC上安装在线过滤/脱气装置，微孔滤膜对流动相过滤去除颗粒的同时还可以脱除分散其中的微小气泡，减少基线波动[2]。

2 微孔滤膜在液体澄清/除菌/除支原体过滤中的应用

在生化实验操作中，经常需要对各种溶液进行澄清处理。最常用的处理方式就是微孔膜过滤法。对于高颗粒物含量或者高粘度的溶液，为了减少滤材因堵塞而频繁更换，可以选择具有高纳污量、低阻力的超细玻璃纤维滤纸进行过滤，但需要注意的是下游可能会有纤维脱落。对于尺寸较小的细微颗粒(0.1～1.0 μm)，则需要采用精度更高的微滤膜来实现去除。使用的过程中，应依据溶液的特性(pH、极性、溶度参数、温度等)，选择合适材质的进行过滤。在经高压蒸汽灭菌、γ辐照或EO熏蒸等方式灭菌后，微孔滤膜及滤器可被用于溶液的除菌过滤，特别是一些含有温敏性物质而无法采用高温蒸汽灭菌的溶液。因而这种除菌方式又被成为“冷除菌”。生化实验中常见的培养基、缓冲液、血清、蛋白溶液等都可以采用微孔滤器进行除菌。能够通过107CFU/cm2缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta,ATCC 19146)挑战水平测试的微孔过滤器被认为是“除菌级”，其孔径等级被定义为0.22 μm或0.2 μm[3-4]。此外，0.1 μm孔径等级的微孔滤膜被认为是可以在一定程度上除支原体。美国Merck millipore公司和美国Pall公司均先后推出了商品化的0.1 μm除支原体过滤器[5]，但这些产品都是基于自己的公司的产品标准。目前国际上除支原体过滤器的测试标准尚属空白。上述的应用信息汇总见表1。

表1 液体澄清/除菌/除支原体过滤应用性能汇总Table 1 Application performance summary of liquidclarification / sterilization / mycoplasma removal filters

3 微孔滤膜在无菌通气(气体无菌过滤)过程中的应用

0.22 μm孔径等级的疏水聚四氟乙烯(PTFE)和疏水聚偏二氟乙烯(PVDF)微孔滤膜因其自身天然的强疏水性和良好的阻菌性能，被广泛用于无菌通气，如实验室规模的微生物发酵、细胞培养、植物无土培养。

微生物好氧发酵过程中需使用Φ 50 mm 0.22 μm 疏水PTFE微孔滤膜制成的蝶式过滤器进行无菌通气。PTFE蝶式过滤器让发酵时产生代谢气体从内部经膜孔排出发酵罐，同时外部空气经膜孔进入发酵罐内，而环境中的杂菌和灰尘则被滤膜阻挡在外，避免发酵罐内感染杂菌。

PTFE膜也可以应用在细胞培养(悬浮培养和贴壁培养)。0.22 μm PTFE微孔滤膜被焊接在细胞培养瓶的瓶盖上，起到阻菌和换气的作用。

4 微孔滤膜在微生物检测和计数中的应用

在二十世纪六十年代，世界各国已经开始推广基于微孔滤膜的微生物检测分析技术[6]。目前，微孔滤膜法是一种国际公认的微生物标准检验方法。该方法已经写入到美国USP、欧洲EP、日本JP和中国药典2015版中，并得到FDA和EPA等组织的承认，广泛应用于药品、食品饮料、化妆品的微生物指标控制和洁净环境检测等领域。微孔滤膜过滤法(又称薄膜过滤法)是指采用一定孔径等级的无菌微孔滤膜截留流体里的微生物，然后转移至合适的培养基上进行培养及菌落计数。该过程常被应用于微生物限度检测和无菌检测。与传统平皿涂布法相比，薄膜过滤法具有不受样品体积限制、可洗去抑制物、高灵敏度等优点。

用于检测和计数的微孔滤膜材质主要有混合纤维素酯(MCE)膜和硝酸纤维素酯(NC)膜。后者较脆，而前者在后者基础上加入了醋酸纤维素酯(CA)材料，使其具有更好的韧性。膜面上一般会用非抑菌性的油墨印上网格，方便菌落形成后计数。滤膜孔径等级包括0.22 μm、0.45 μm、0.65 μm、0.8 μm和1.2 μm几种。其中0.45 μm应用的最为广泛，兼顾了对微生物的高截留效率和对液体的快速过滤要求，可用作细菌总数计数，微生物复活率可达到90%以上(相比平板涂布法)。0.22 μm相比0.45 μm对微生物的截留滤更高，但流速慢。0.65 μm、0.8 μm和1.2 μm实际孔径较大，流速快，但截留性能低，不适合细菌总数计数，主要用于酵母和霉菌的培养、计数。关于上述的应用要求，由美国材料与试验协会(ASTM)研究制定了一系列标准测试方法，来评判产品是否符合要求，列于表2。

表2 ASTM关于微孔滤膜在微生物检测和计数的系列标准Table 2 Series of ASTM standards for microporous filters in microbial detection and counting application

5 微孔滤膜在蛋白和核酸检测中的应用

20世纪70年代，学者们发现微孔滤膜可以吸附生物分子(DNA、RNA和蛋白质)，进而逐渐开发出了Southern Blotting、Northern Blotting、Western Blotting和Eastern Blotting几种检测方法。生物分子主要通过疏水作用结合到滤膜上，而微孔滤膜所带电荷也对生物分子的结合起到一定的作用。常用的转印膜有硝酸纤维素酯(NC)膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜和尼龙滤(Nylon)膜。三种滤膜各有其优缺点，进行转印操作时需要根据实际情况进行选择。

Western Blotting，又称蛋白质印迹，是指利用十二烷基磺酸钠―聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳将不同分子量的蛋白质进行分离，并将蛋白质转印到微孔滤膜上，然后用特定的一抗和二抗与目标蛋白进行特异性结合、显色，检测目标蛋白的一种方法。适用于Western Bloting的滤膜主要有NC和PVDF滤膜。NC膜是最早用于Western Blotting的微孔滤膜，其操作简便，价格便宜，背景低，但是膜本身较脆且容易卷，蛋白结合力略差，且不能重复使用。PVDF转印膜于1985年推出应用于蛋白质印迹。与NC膜相比，其价格更昂贵，但蛋白结合能力更高，膜的韧性更好，可重复使用[13]。

6 微孔滤膜在环境空气细颗粒物(PM2.5)监测中的应用

近年来我国环境污染问题日趋突出，特别秋冬季节全国范围内长时间的雾霾污染，对人们的健康、生活和工作造成了严重的影响。政府对空气污染问题空前重视，不断加大对环境空气监测活动的投入。

PM2.5指环境空气中空气动力学当量直径小于等于2.5 μm的颗粒物，也称细颗粒物。其监测方法主要有重量法、β射线法和微量震荡天平法。这些方法通常需要采用微孔滤膜作为空气采样的载体。2013年，中华人民共和国环境保护部发布了《HJ 656-2013环境空气颗粒物(PM2.5)手工监测方法(重量法)技术规范》，该规范推荐微孔滤膜材质可选用玻璃纤维滤(GF)膜、石英(Quartz)滤膜等无机滤膜和聚四氟乙烯(PTFE)、聚氯乙烯(PVC)、聚丙烯(PP)、混合纤维素酯(MCE)等有机滤膜，要求对0.3 μm标准粒子的截留效率不低于99.7%[14]、采样后微孔滤膜还可以用于环境空气污染颗粒物来源解析工作。该种滤膜的本底值应满足化学分析要求，化学稳定要强，不与沉积物发生化学反应。在进行解析工作的时候，还需要根据滤膜本身的特性和采样后用于化学分析的需求来选择分析方法[15]。

7 微孔滤膜在医疗诊断试纸中的应用

微孔滤膜在体外诊断试纸领域有着广泛的应用，目前应用形式主要为垂直流和侧向流两种，具体应用点包括糖尿病检测、心脏标志物检测、肿瘤标志物检测、妊娠检测等。我国人口基数大，农村人口比例多，然而具备高端设备的大型医院数量有限，难以满足目前的医疗需求。体外诊断试纸因其快速、高效、廉价等优点，非常适合于基层医疗的检测要求。

微孔滤膜作为载体膜用于垂直流测试，主要起到固定抗体、抗原、酶等物质的作用，待测样品由膜的上端流至下端，故称垂直流。常用膜材为聚醚砜和玻璃纤维材质，厚度一般在100～140 μm，膜标称孔径在0.05～0.45 μm之间。

微孔滤膜作为载体膜用于侧向流测试，待测样品由膜的左侧经毛细效应流向右侧，故称侧向流。常用膜材为硝酸纤维素膜，标称孔径为4～10 μm，膜厚度在150～240 μm，NC膜带正电，对带负电的蛋白质具有很强的吸附作用，在其上负载抗体或抗原，可以对相应物质进行检测[16]。

8 微孔滤膜在实验室研究与分析检测方面的应用发展趋势

微孔滤膜自20世纪初诞生至今经历了近100年的发展，膜的品种和规格不断丰富和完善，以适应日益细分的行业应用。未来，由于实验室分析检测工作对研究测试高效性和数据结果精准性的要求，微孔滤膜产品在该方向的应用发展趋势将主要朝着“集成化和自动化”的方向发展。原本需多环节操作实现的功能，将可由一个高度集成的单元一步实现，从而在减少繁琐的操作流程的同时，还能提高结果的精准性和重复性。微滤产品的设计将更多的符合自动化操作的要求，进而实现大量、快速的操作。

[1] 陈昌骏.微孔滤膜[J].净水技术，1998(4):31-36.

[2] 孙静涵.高效液相色谱及样品前处理技术在药物和环境分析中的应用研究[D].重庆:西南大学，2009.

[3] American Society for Testing and Materials. ASTM F838-15a Standard test method for determining bacterial retention of membrane filters utilized for liquid filtration[S].West Conshohocken:American Society for Testing and Materials,2015.

[4] 德国标准化学会(DIN).DIN 58355-3，Membrane Filters - Part 3:Bacteria Challenge Test For Flat Filters - Requirements And Testing[S].[S.l.]:[s.n.],2005.

[5] 张雅会，李少丽，李艳丽.一种去除猪圆环病毒中支原体污染的方法[J].现代畜牧兽医,2016(8):42-44.

[6] 刘国良，朱守一.使用微孔滤膜的微生物检验技术[J].中国医药工业杂志, 1975(6):66-69.

[7] American Society for Testing and Materials. ASTM D3862-13，Standard test method for retention characteristics of 0.2-μm membrane filters used in routine filtration procedures for the evaluation of microbiological water quality[S].West Conshohocken:American Society for Testing and Materials,2013.

[8] American Society for Testing and Materials.ASTM D3863-87(2011)，Standard test method for retention characteristics of 0.40 to 0.45-μm membrane filters used in routine filtration procedures for the evaluation of microbiological water quality[S].West Conshohocken:American Society for Testing and Materials,2011.

[9] American Society for Testing and Materials.ASTM D4196-05(2011)，Standard test method for confirming the sterility of membrane filters[S].West Conshohocken:American Society for Testing and Materials,2011.

[10] American Society for Testing and Materials. ASTM D4198-82(2011) Standard test methods for evaluating absorbent pads used with membrane filters for bacteriological analysis and growth[S].West Conshohocken: American Society for Testing and Materials, 2011.

[11] American Society for Testing and Materials .ASTM D 4199-82(2011)，Test methods for Aautoclavability of membrane filters[S].West Conshohocken:American Society for Testing and Materials,2011.

[12] American Society for Testing and Materials. ASTM.D4200-82(2011)，Standard test method for evaluating inhibitory effects of ink grids on membrane filters[S].West Conshohocken: American Society for Testing and Materials,2011.

[13] 李晓军，秦浚传，武建国.蛋白印迹技术研究进展[J].临床检验杂志,2004,22(3):227-229.

[14] 中华人民共和国环境保护部.HJ 656-2013 环境空气颗粒物(PM2.5)手工监测方法(重量法)技术规范[S].北京: 中国环境出版社中国标准出版社,2013.

[15] 中国环境监测总站.环境空气颗粒物来源解析监测方法指南(试行)(第二版)[OL]. http://www.cnemc.cn/showReport.do?cateId=2092926&contentId=40445&siteId=2002.html,2014.

[16] 马红艳，李 强.胶体金诊断试剂盒中层析膜材料性能的分析[J].膜科学与技术，2002，22(6):14-18.