山西省86个审定玉米品种的遗传多样性分析

程宇坤 ，白建荣 ，2，李 锐 ，侯流沙 ，姚仙玲

（1.山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原 030031；2.山西省农业科学院现代农业研究中心，山西太原 030031；3.山西省农业种子总站，山西太原 030006）

玉米杂交种的遗传变异信息是选育品种的重要基础数据。玉米杂交种的遗传多样性可从已审定的杂交种和杂交种亲本的遗传多样性2个方面开展研究。通过亲本来评价杂交种的遗传多样性已有很多报道[1-7]。近年来也开始重视直接对杂交种进行遗传多样性的分析[8-17]。审定品种代表了当前玉米育种的动向和水平，因此，在不便对亲本自交系进行直接研究和系谱分析的情况下，深入分析审定玉米杂交种的遗传多样性及其变化趋势，可以从整体上客观地掌握当前玉米育种现状和种质基础，对于育种家进一步拓宽品种遗传基础、及时调整育种策略具有重要意义。

玉米是山西省的重要作物，全省70%以上的粮食产量来自于玉米。山西省独特的地理位置和生态环境的多样性，几乎全国的玉米品种在山西都可以种植，而且在山西选育的品种也可以在其他省份找到合适的种植区域。近年来，山西省培育了许多优良玉米自交系和杂交种，同时，许多其他省份的品种在山西省经区域试验通过了品种审定，这些品种的交流对全国玉米育种的发展产生了积极的影响。目前，山西省审定玉米品种的遗传多样性尚未见报道。利用SSR分子标记研究其遗传多样性是目前较为可靠而且普遍采用的方法[11-12]。

本研究利用SSR技术对山西省86个玉米审定品种的遗传多样性进行了分析，研究结果将有利于育种家熟悉山西省玉米种质遗传基础，挖掘、利用与保存该地区特异种质资源，制定更加合理的育种策略。

1 材料和方法

1.1 试验材料

山西省审定玉米品种101份，绝大部分为2000—2009年审定的品种，少部分为2000年前审定且大面积推广、经济效益好的品种。其中，51份由山西省农业种子总站提供，其余50份从山西省不同的育种单位收集得来。经纯度检测后确定86份材料为试验材料（表1）。

表1 试验材料

续表1

1.2 DNA模板制备

每份材料取10株，单株提取DNA。经浓度和质量检测后，将DNA样品稀释至20 ng/μL，低温保存。

1.3 引物选择

以中华人民共和国农业行业标准（NY/T1432—2007《玉米品种鉴定DNA指纹方法》）的20对核心引物为基本核心引物；另外增加了近年来山西省农业科学院作物科学研究所分子设计实验室筛选出符合指纹图谱构建的28对引物。引物信息列于表2。

扩增反应在BIO-RAD公司的C1000上完成。PCR反应体系为20μL，其中，1×PCRBuffer，25mmol/L Mg2+2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.1 μL，10 μmol/L SSR引物 1 μL，Taq DNA聚合酶 0.5 U，DNA模板 80 ng。PCR反应程序为：95℃预变性5 min，1个循环；94℃变性 1 min，55℃退火 30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。扩增产物在6%聚丙烯酰胺变性凝胶中进行电泳分析。电泳结束后，凝胶经硝酸银染色法染色并室温干燥，在白炽灯下观察电泳结果，并进行数据统计和扫描照相。

1.4 一致性检测

用2007年国家农业部标准《玉米品种鉴定DNA指纹方法》规定的20对标准引物对5株供试材料进行一致性检测。将每一份材料3株以上在某一位点都有的带型作为该位点该材料的代表带型。如20对引物在每一份材料都能找到代表带型的单株，则将这些株的DNA混合作为这份材料的模板DNA。如用5株不能确定某个引物的带型，则要扩大到10株。如果在某份材料不能找到20对引物都有确定带型的单株，则这份材料没有代表株。本研究以代表株的带型作为统计带型。

表2 SSR引物在审定玉米品种中的等位变异及多态信息量

1.5 数据分析

以0，1和9形式统计SSR扩增带型，在相同迁移位置上，有带记为1，无带记为0，缺失记为9，建立数据库。

其中，Ni为i品种出现的谱带数，Nj为j品种出现的谱带数，Nij为i，j品种共有的谱带数。

多态性信息量（Polymorphism information content，PIC）按公式计算，其中，fi为第i个等位基因出现的频率。

采用NTSYS-PC2.02软件的不加权成对群算术平均法（Unweighted pair group method rithmetic averages，UPGMA）进行聚类分析。

特有等位变异是指该等位变异只在一个检测材料中出现；稀有等位变异是指该等位变异的频率小于5%。

2 结果与分析

2.1 SSR标记检测结果

首先选用覆盖玉米全基因组的20对SSR核心引物（P1～P20，每个染色体臂1对）对101份玉米品种进行一致性检测，由于P3和P6的扩增效果不理想，只取了18对SSR引物的结果，有86份材料能够找出该材料的代表株。将这些代表株的DNA等量混合作为每一份材料的模板。然后用46对SSR引物对86份玉米品种扩增并进行电泳分析（图1，2）。从表2可以看出，选用的SSR引物在所有的供试材料中都有多态性，共检测出307个等位变异，每对引物检测出的等位变异为3～11个，平均每个位点6.67个，检测到等位变异最多（11个）的位点是mmc0191。所有位点的平均PIC为0.71，变幅为0.25～0.86。

2.2 品种中检测到的稀有和特有等位基因

在86个杂交种中，稀有等位变异是等位变异数为2～4个的等位变异，特有等位变异是等位变异数为1的等位变异（表3）。从表3可以看出，其中55个品种出现稀有等位变异，共计86个，有17个品种的稀有等位变异数为2个，4个品种为3个，2个品种（屯玉10341和大丰2号）为4个。15个品种发现特有等位变异，共计18个，其中，晋鲜糯6号、晋糯8号和屯玉60各有2个特有等位变异。

表3 不同审定玉米品种中检测出的稀有和特有等位变异

续表3

2.3 聚类分析结果

依据46个SSR标记数据，应用UPGMA对86份杂交种进行了聚类分析（图3），各品种间的遗传相似系数为0.71～0.96。以0.74为阈值，86个品种大体划分为7类群：最大的一类群为Ⅲ群，包含有48个品种；Ⅶ群只有大丰1号和大丰2号；Ⅳ群有屯玉的8个品种；Ⅰ群中有9个品种，其中，5个是利马格兰种业的品种；屯玉青贮50、屯玉68和安森7号形成了Ⅵ群；Ⅱ群和Ⅴ群分别有11，5个品种。

3 讨论

利用SSR分子标记来研究玉米种质遗传多样性是目前较为可靠而且普遍采用的方法。在这类研究中，提取DNA的方法既有混合取样[7，10]，也有单株取样[6]，还有将每个品种随机取20粒种子，以16～19对SSR引物进行一致性分析，将有代表性的5粒种子DNA混合建立该品种的DNA指纹图谱及遗传多样性分析[8]。玉米为二倍体作物，理论上，杂交种在每个SSR位点的带型或为1条、或为2条。山西省农业科学院作物科学研究所分子设计育种实验室科研人员在以前的研究中发现，混合取样后在SSR分析时有些位点在某些材料产生的带型则为3条，如果这种情况发生在多个位点及多个材料，这样的结果不准确，可能在自交系繁育时也可能在杂交时混入了其他花粉所至。单粒取样作为供试材料的代表，所取材料也有可能无法代表供试材料。虽然以20粒种子和19对引物作一致性检测的方法比较准确，但是大大增加了工作量。本研究首先采用一致性检测，选出代表植株的方法，这样既保证了试验数据的可靠性，也减少了工作量。

所有供试品种之间的遗传相似性系数＞0.70，有些超过了0.85，有极个别的甚至超过了0.9。这表明山西省审定玉米品种之间的亲缘关系较近，遗传基础趋同化。值得注意的是，1/2以上的品种（48个）聚为一类，山西省的各育种单位在此类里都有品种，说明各育种单位有些育种思路相似，育种材料也有可能互相交流。同时也反映了大量使用具有某些优良性状的遗传材料育成的新品种大幅度增加，造成了生产上品种遗传基础趋于单一化。但是，有些种业公司的品种有自己的特色，如大丰种业、利马格兰种业和屯玉种业，其品种独立聚群。

本研究还发现，来源于同一育种单位选育出的品种优先聚为一类，一方面这些品种共同使用一个亲本，如Ⅶ群中大丰1号和大丰2号；另一方面，亲本是来源相近的姊妹系，如Ⅳ群中屯玉的8个品种，Ⅰ群中利马格兰种业的品种。这表明，育种单位创新的优良自交系少，改良与重复利用的较多。

稀有等位变异和特有等位变异从另一个方面反映了供试材料的异质性。本研究检测到55个（63%）品种中都有数目不等的稀有等位变异，其中，屯玉10341和大丰2号有4个稀有等位变异。这说明，近年来山西省各育种单位，特别是各种业公司注重引进和利用外源种质。15个品种有特有等位变异（特征引物带），其中，屯玉60和晋鲜糯6号有2个特有等位变异，这些可作为鉴定这些品种的标签，同时暗示含有这些特有等位变异的亲本自交系可能蕴涵着独特的重要优良基因，需进一步深入、细致地研究，使其成为培育新的优良骨干自交系的材料来源。

参考文献：

［1］李新海，傅骏骅，张世煌，等.利用SSR标记研究玉米自交系的遗传变异[J].中国农业科学，2000，33（2）：1-9.

［2］XIE C，ZHANG S，LI M，et al.Inferring genome ancestry and estimatingmolecular relatedness among187 Chinese maize inbred lines[J].Journal ofGenetics and Genomics，2007，34（8）：738-748.

［3］肖木辑，李明顺，李新海，等.黄淮海地区主要玉米自交系的SSR遗传多样性分析[J].玉米科学，2008，16（2）：1-7.

［4］聂永心，张丽，潘光堂，等.四川省常用玉米自交系SSR遗传多样性分析[J].分子植物育种，2005，3（1）：43-51.

［5］李锐，白建荣，张丛卓，等.山西中晚熟玉米区玉米自交系的遗传多样性及杂种优势群分析 [J].山西农业科学，2013，41（4）：311-316.

［6］赵文博，白建荣，王陆军，等.山西省主推玉米品种自交系的SSR遗传多样性分析[J].山西农业科学，2008，36（10）：19-22.

［7］石海春，袁昊，李东波，等.82份玉米自交系遗传多样性分析[J].华北农学报，2014，29（6）：84-93.

［8］李俊芳，孙世贤，王守才.国家玉米主产区预试品种的SSR分析Ⅱ.预试品种的遗传多样性[J].玉米科学，2007，15（1）：16-20.

［9］葛建镕，刘晓鑫，易红梅，等.吉林省42份主推玉米杂交种的遗传分析[J].农业与技术，2008，28（5）：37-42.

［10］高玉倩，田红丽，王凤格，等.吉林省玉米新品种SSR标准指纹数据库的构建及其分析[J].玉米科学，2012，20（3）：43-47.

［11］朱志成.不同玉米品种SSR遗传多样性分析的研究[J].种子世界，2013（8）：30-31.

［12］刘云婷，张秋兰，王倩，等.河北省玉米种子质量评价及遗传多样性分析[J].河北农业大学学报，2015，38（4）：8-12.

［13］高永钢，高军，贾晋，等.内蒙古地区主要推广玉米品种遗传多样性研究[J].宁夏大学学报，2014，35（1）：78-81.

［14］吴毅歆，刘春明，毛自朝，等.云南省222个玉米新品种DNA指纹图谱构建和遗传多样性分析 [J].分子植物育种，2012，10（28）：1199-1205.

［15］王凤格，田红丽，赵久然，等.中国328个玉米品种（组合）SSR标记遗传多样性分析 [J].中国农业科学，2014，47（5）：856-864.

［16］赵久然，王凤格，郭景伦，等.中国玉米新品种指纹库建立系列研究Ⅱ.适于玉米自交系和杂交种指纹图谱绘制的核心引物的确定[J].玉米科学，2003，11（2）：3-5.

［17］WANG F G，TIAN H L，ZHAO J R，et al.Development and characterization of a core set of SSR markers for fingerprinting analysis ofChinese maize varieties[J].Maydica，2011，56（1）：7-17.