盐度胁迫对泥蚶存活率及3种酶活力的影响

2018-04-19郑伊诺许凯伦曾国权陆荣茂

浙江农业科学 2018年4期

李　敏，郑伊诺，许凯伦，曾国权，陆荣茂，胡　园*

(1.浙江省海洋水产养殖研究所，浙江温州　325005； 2.浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室，浙江温州　325005)

近年来，干旱、暴雨频发等自然因素以及人为因素的影响给滩涂贝类的生存环境带来巨大改变，其中盐度受环境的变化更显著。盐度是影响贝类分布和生理代谢最重要的生态因子之一，在不同地理环境中分布的贝类，其可耐受的盐度范围不同，因而盐度的变化对贝类的生理活动会造成一定影响[1-5]。一般而言，海水的盐度直接影响贝类体内的渗透压，当海水盐度改变时，为适应环境，机体需重新平衡体内外的水盐系统，消耗能量，贝类的正常生长就会受到影响，只有在一定的盐度范围内，水生动物的生长才能达到最大速度。

泥蚶(Tegillarcagranosa)隶属软体动物门(Mollusca)，双壳纲(Bivalvia)，蚶属(Tegillarca)，是潮间带中重要的养殖种类。目前，在温度、重金属等胁迫对泥蚶影响的研究方面已有报道[6-8]，但是有关盐度胁迫对泥蚶基础生理代谢的研究资料不多。本试验以泥蚶为研究对象，研究了盐度胁迫下泥蚶血浆渗透压、过氧化物酶(POD)活力、总超氧化物歧化酶(TSOD)活力及组织Na+/K+-ATP酶活力的变化规律，旨在为泥蚶的渗透生理调节及适应机制的研究提供基础数据。

1　材料与方法

1.1　材料

供试用泥蚶于2016年6月底购自浙江温岭。从中选择活动能力正常、健康、个体大小均匀的泥蚶进行试验，试验选取的泥蚶平均壳长(3.43±0.07) cm，平均壳高(2.70±0.06) cm，平均体重(15.63±0.80) g。

1.2　方法

1.2.1处理设计

本次试验采取静水系统，设定8个盐度梯度，盐度分别为0、0.5%、1.0%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，另设置与贝类取样区域海水盐度相似的盐度1.5%作为对照组，其他盐度组为实验组，各设3个平行组。通过加人工海水精盐配制所需盐度梯度，每隔24 h全量换水1次。2016年7月3—8日，每天取样检测1次。

1.2.2检活方法

每天定时取出10只大小相近、活力相当的泥蚶置于常温海水静置1 h后，采用目测法检活，即活泥蚶双壳紧闭，绞合缝严密，用手掰不开，自动张口的稍一触动即迅速闭合。

1.2.3样品的制备

将泥蚶置于冰盘上，使用无菌注射器快速抽取血液，移入样品管中冰浴，将血液置于低温离心机，10 000 r·min-1速度下离心8 min，取上层液用以测定血浆渗透压、POD活力及TSOD活力，样品在24 h内分析完毕。

取样品组织时，每次每组随机取6只试验泥蚶，将其置于冰盘上解剖，用预冷的0.86%生理盐水清洗2次，除去血液，用干净滤纸擦拭干净后取出组织置于5 mL干净的预冷的离心管中，加入预冷的0.86%生理盐水制成组织匀浆液，再将匀浆液置于3 000 r·min-1速度下离心10 min，取上清液测定有关数值。

1.2.4样品的测定

血浆渗透压的测定：利用Model型冰点渗透压计测定血浆渗透压，血浆渗透压单位用mOsm·kg-1表示。

酶活力的测定：POD活力、TSOD活力及Na+/K+-ATP酶活力的测定均采用南京建成生物研究所生产的试剂盒，具体操作按试剂盒说明书进行。

血浆POD活力单位：每毫升血浆每分钟催化1 μg底物的酶量为一个POD活力单位(U·mL-1)。

血浆TSOD活力单位：每毫升血浆在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位(U·mL-1)。

组织Na+/K+-ATP酶活力单位：每小时每毫克组织蛋白的组织中三磷酸腺苷酶分解三磷酸腺苷产生1 μmol无机磷的量为一个酶活力单位(U·mg-1)。

1.3　成活率的计算

成活率=(成活数/总数)×100。

1.4　数据处理

所有数据均以平均值±标准差表示，采用SPSS 9.0分析软件对实验数据进行单因素方差分析(ANOVA)。P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2　结果与分析

2.1　盐度胁迫对泥蚶成活率的影响

由表1可以看出，不同盐度胁迫对泥蚶的存活率的影响不同。试验过程中，盐度为3.5%、4.0%时，1 d内泥蚶的死亡率达到100%，盐度为3.0%，2 d时全部死亡，这2组在1 d时存活率极显著低于对照组。而盐度为2.0%、2.5%时3 d的存活率与对照组基本相同，均为60%。试验到4 d时0、0.5%、1.0% 3组存活率均为100%，到试验结束时 3组的存活率为50%。由此可以看出，随着时间的进行盐度的变化对泥蚶存活率影响可表示为低盐度组(0、0.5%、1.0%)>对照组(1.5%)和中盐度组(2.0%、2.5%)>高盐度组(3.0%、3.5%、4.0%)。

表1　盐度胁迫下泥蚶的存活率　%

2.2　盐度胁迫对泥蚶血浆渗透压的影响

不同盐度对泥蚶血浆渗透压的影响见图1，由图1可以看出不同盐度对泥蚶血浆渗透压的影响不同，盐度3.5%、4.0%在实验1 d时血浆渗透压达(1 332±10) mOsm·kg-1、(1 661±18) mOsm·kg-1，较开始分别增加了122.4%和177.3%，极显著高于其他组；盐度3.0%渗透压随着试验的进行呈明显上升趋势，在2 d时渗透压值最大，为(1 082±5) mOsm·kg-1，较开始增加了80.6%；盐度2.0%、2.5%在3 d时渗透压值最高，分别为(708±1) mOsm·kg-1、(1 026±44) mOsm·kg-1，较开始分别增加了18.2%和71.3%；对照组渗透压值由试验开始的(599±5) mOsm·kg-1，在1 d时先降低到最低值[(550±2) mOsm·kg-1]后增加，到试验结束时达到(560±5) mOsm·kg-1；低盐度的2个组(0、0.5%)，渗透压值随时间的增加而降低，分别较开始降低了42.2%、56.4%，均显著低于对照组及其他实验组。

图1　不同盐度对泥蚶血浆渗透压的影响

2.3　盐度胁迫对泥蚶血浆POD活力及TSOD活力的影响

不同盐度对泥蚶血浆POD活力及TSOD活力影响见图2，由图2可知不同盐度胁迫下各处理组POD活力不同，随时间的增加盐度3.5%、4.0%组POD活力显著降低，分别由1 d的(62.63±2.00) U·mg-1、(63.78±0.88) U·mg-1降低至(28.30±4.87) U·mg-1、(24.52±2.09) U·mg-1，分别降低了54.8%、61.6%；低盐度组均较1 d时增加且在第5天的值最高，分别为(60.78±9.92) U·mg-1、(74.44±6.41) U·mg-1、(76.37±9.91) U·mg-1，分别增加了4.1%、42.6%、43.5%；对照组及其他2组均呈先降后增趋势，在2 d时降低至最低值。

图2　　　　不同盐度对泥蚶血浆POD活力及TSOD活力的影响

从图2可以看出，不同盐度胁迫下各处理组TSOD活力不同，试验各组总体呈现下降趋势，对照组TSOD活力由1 d时的(207.41±2.63) U·mL-1下降至(122.22±28.10) U·mL-1，下降了41.1%；盐度0、0.5%、1.0%、2.0%泥蚶血浆TSOD活力随时间的增加而降低，分别下降了48.4%、80.1%、64.2%、34.6%；盐度2.5%泥蚶血浆TSOD活力呈先增后降趋势，在2 d时增加至最大，后较1 d降低9.8%；盐度3.0%泥蚶血浆TSOD活力较1 d时增加22.7%，对照组TSOD活力显著高于盐度0组，极显著高于盐度0.5%、1.0%组。

2.4　盐度胁迫对泥蚶Na+/K+-ATP酶活力的影响

盐度胁迫对泥蚶Na+/K+-ATP酶活力的影响如图3所示，试验过程中低盐度各组呈现先降后增趋势，对照组及中盐度组呈降低趋势。与试验开始相比各组均有所降低，其中对照组由开始的(1.805±0.004) U·mg-1降至(0.465±0.099) U·mg-1，降低了74.2%。低盐度组在试验结束时分别为(0.562±0.126) U·mg-1、(0.737±0.059) U·mg-1、(0.659±0.130) U·mg-1，分别降低了68.9%、59.2%、63.5%。中盐度组较开始分别降低了76.2%、81.8%。实验结束时泥蚶组织NA+/K+-ATP酶活力呈现低盐度组>对照组>中盐度组。

图3　　　　不同盐度对泥蚶Na+/K+-ATP酶活力的影响

3　讨论

泥蚶是变渗压生物，没有专门的渗透压调解器官，环境因素尤其是生长环境的盐度变化对泥蚶生长和生命活动有重要影响，当泥蚶生长环境的盐度升高或降低幅度过大时会出现闭壳及进出水管收缩关闭，进而导致泥蚶摄食活动减少、生长速度减慢等。本次试验中对照组及盐度为2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的实验组在试验结束前全部死亡，可能是由于泥蚶的渗透调节能力较弱，在盐度高于1.5%条件下，渗透调节已经接近极限，超过此极限，泥蚶即大量死亡。研究表明，泥蚶在低盐度的海水中死亡率显著低于高盐海水中的死亡率，对高盐更敏感，这与尤仲杰等[9]在海水温度盐度对泥蚶稚贝生长及存活的影响的研究中结果一致。这可能是由于泥蚶栖息于海水盐度较低且相对稳定的水域，长期的适应使泥蚶缺乏长期耐受高盐的能力。

试验发现，低盐度的2个试验组(0、0.5%)渗透压值，随时间的增加而降低且均低于对照组及其他试验组，盐度2.5%、3.0%、3.5%、4.0%处理在试验1 d时渗透压值明显增加，且均显著高于其他各组，这与蔡星媛等[4]在盐度胁迫对魁蚶稚贝血液渗透压影响的研究中结果一致，对照组较开始渗透压值略有降低。可能因为当环境盐度发生改变时，双壳贝类会紧闭双壳、关闭进出水管和外套腔来缓解高盐或低盐胁迫的压力。试验过程中也发现，泥蚶在盐度胁迫时首先会关闭贝壳，随后才逐渐缓慢开壳，随着试验时间的增加，低盐胁迫下泥蚶闭壳时间相对较短，而盐度2.5%、3.0%、3.5%、4.0%处理开、闭壳次数减少，频率也减少，因此若长期处于高盐胁迫环境中泥蚶的生长和存活均会受到一定影响。

盐度胁迫下贝类渗透压变化，随之其生理活动发生变化，在这个过程中贝类体内酶的活力也发生变化[10-12]。POD是一种生物氧化中的末端氧化酶[13]，它广泛存在于生物各个组织中，能催化分解过氧化氢从而起到保护生物体的作用。本次试验表明，高盐度组POD活力较开始显著降低，低盐度组较开始显著增加。试验结束时POD活力依次为低盐度组>对照组> 高盐度组，即POD活力与盐度高低呈负相关。这与吕昊泽等[10]以及李子牛等[11]的研究结果相类似。表明盐度胁迫时，泥蚶为适应环境通过增大POD活力来增强渗透压适应能力，从而减少环境对机体造成的伤害。而当盐度较大时，POD活力下降，可能是盐度影响超过了泥蚶自身调节能力，因而在试验过程中出现部分死亡现象。与POD活力相比TSOD活力开始时增加后降低趋势更明显，这与吕昊泽等[10]的研究结果相似，说明TSOD对盐度胁迫更为敏感。

海洋无脊椎动物组织中Na+/K+-ATP酶在其应对环境中盐度变化过程中发挥作用，Na+/K+-ATP酶活力与部分鱼类、双壳贝类等渗透压的调节能力显著相关。试验结果表明，低盐度各组呈现先降后增趋势，对照组及高盐度组呈现降低趋势。实验结束时泥蚶组织Na+/K+-ATP酶活力呈现低盐度组>对照组>中盐度组。这与林听听等[14]的研究结果不同，林听听等[14]的研究发现：在不同盐度胁迫下青蛤鳃组织中Na+/K+-ATP酶活性在低盐时增加，高盐时下降。可能由于试验对象及试验盐度胁迫方式不同，泥蚶较青蛤而言在盐度胁迫下自身渗透压的调节时间不同，并且本次试验不是采取盐度骤升或骤降的方式进行胁迫，使得结果略有差异。