不同苎麻品种根际土壤细菌多样性

汤涤洛，涂修亮，潘国雄，熊 伟，汪红武

(1.咸宁市农业科学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北省苎麻工程技术研究中心，湖北 咸宁 437100)

【研究意义】微生物是地球上多样性最高的生命形式[1]，几乎分布到地球上的所有生境[2]，土壤中微生物数量庞大是最丰富的微生物资源库[3]，而细菌是土壤中数量最丰富、分布最广泛的微生物类群[4]，占有绝对优势[5-6]。土壤细菌广泛参与土壤有机质积累，参与土壤中大多数养分的转化[7-8]，所以土壤细菌被作为评估土壤环境变化的指示型标志[9]，与土壤理化性质、土壤深度等诸多因素有关[10]。【前人研究进展】传统的土壤微生物培养方法存在着耗时、工作量大的缺点，并且大多数土壤微生物是不可培养的，从而导致无法全面了解土壤微生物信息[11]。Illumina高通量测序技术为人们认识土壤微生物多样性提供了新的契机。Illumina测序技术不仅具有低成本、高通量和低错误率的优点[12]，还能够快速、简单、较准确地获取土壤微生物信息。【本研究切入点】本研究使用Illumina测序技术开展了不同根型苎麻土壤根际微生物多样性研究。【拟解决的关键问题】探讨苎麻根际土壤细菌与土壤养分的关系，不同根型苎麻土壤细菌多样性，不同根型苎麻土壤细菌在不同分类水平的优势类群、各类群相对丰度。为苎麻土壤微生物研究、土壤细菌与苎麻生产性状相关性研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验地概况与试验材料

试验于2016年1-12月在咸宁市农业科学院崇阳县白霓镇山坡地示范基地进行。

供试苎麻品种分别为湖南中科院麻类研究所的深根型湘苎三号，湖北华中农业大学的中根型华苎四号，湖南张家界的浅根型黄壳麻。

1.2 试验设计

试验区3个处理分别(深根型湘苎三号、浅根型黄壳麻、中根型华苎四号)采用随机区组排列，3次重复，共9个小区，其投影面积85 m2(17 m×5 m)，种苗全部采用统一繁殖的嫩梢扦插苗，2012年4月移栽。苎麻山坡地管理采用苎麻栽培一般管理方法执行。2016年采集不同品种苎麻根际土壤，每个小区多点取样充分混匀，每份土样分为2份，1份测土壤理化性质，1份用于分子生物学研究。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 土壤成分的测定 土壤理化性质试验于2016年三麻测产后分别取 0～20 cm土层混合土样进行分析，分析方法为: 土壤有机质采用重铬酸钾-氧化还原滴定外加热法；土壤速效磷采用 NaHCO3浸提-钼锑抗吸光光度法；土壤速效氮含量用碱解碱解扩散法；土壤速效钾采用醋酸铵浸提-火焰光度法测定；pH值用酸度剂测定法进行测定。

1.3.2 土壤微生物总DNA提取及细菌的高通量测序 采用MOBIO公司的强力土壤 DNA 提取试剂盒提取土壤微生物基因组DNA。所提取的土壤总 DNA 浓度和纯度经过核酸定量仪(NanoDrop ND-1000)检测并纯化后送至上海欧易生物公司进行测序。其测序步骤如下：根据测序区域的选择，使用带 Barcode 的特异引物，KAPA 公司的 HiFi Hot Start Ready Mix 高保真酶进行 PCR，确保扩增效率和准确性。细菌多样性鉴定对应区域：16S V3-V4 区，采用引物343F(5'-TACGGRAGGCAGCAG-3')和798R(5'-AGGGTATCTAATCCT-3')PCR 产物使用电泳检测，检测后使用磁珠纯化，纯化后作为二轮 PCR 模板，并进行二轮 PCR 扩增，并再次使用电泳检测，检测后使用磁珠纯化，纯化后对 PCR 产物进行 Qubit 定量。根据 PCR 产物浓度进行等量混样，并上机测序。

1.4 数据处理及统计方法

使用 Trimmomatic 软件对原始双端序列进行去杂。去杂后的双端序列利用 FLASH 软件进行拼接。同时，利用 usearch 检测并去除序列中的嵌合体序列。

测序数据进行预处理生成优质序列之后，采用 UPARSE 软件，序列相似度大于或等于 97 %，将序列归1个OTU(Operational taxonomic units)。使用 QIIME 软件包挑选出各个 OTU 的代表序列并统计每个OTU中的丰度信息。利用 QIIME 软件计算Chao1指数[13]、Shannon指数[14]和 Simpson 指数[15]。通过 SPSS 17.0[16]软件进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同根型苎麻种植地土肥状况

从表 1 可知，不同根型苎麻种植山坡地土壤的有机质、速效氮有显著性差，且中根型(B)最低。但是中根型(B)速效磷含量在3个品种是最高，并达到显著性差异。速效钾含量深根型(A)最高，有机碳浅根型(C)最高，pH值相差不大。

表1 不同根型苎麻种植山坡地土壤养分比较

注：数值为平均数±标准误，不同字母表示差异显著(α=0.05)。下同。

Note: Data in the table are mean±SE. Different small letters in the same row mean significant difference at 0.05 level among treatments.

表2不同处理土壤细菌序列读数(reads)及OTUs数

Table 2 Reads and OTUs numbers of soil bacteria sequences in the different treatments

处理Treatment序列读数ValidreadsOTUs数OUTs_counts深根型(A)28001±5311a2793±192a中根型(B)28416±4115a2473±153ab浅根型(C)28046±6452a2255±99b

2.2 土壤样品测序

2.2.1 测序 通过测序将9个样品中原始序列过滤掉低质量的序列后再拼接得到有效序列总数为278 279，根据Barcode标签进行样品序列拆分，在对初始序列进行去冗余处理后获得257 100条Reads，然后在97 %相似度下将其聚类为用于物种分类的OTU并统计，得出9个样品共产生24 268个OTUs，测序读长在 139～543 bp，平均测序长度在420 bp左右。每个处理的序列读数数量如表2 所示。深根型(A)处理土壤含有最多数量的OTUs，其次是中根型(B)处理, 浅根型(C)处理OTUs数量最少。与深根型(A)相比，浅根型(C)处理土壤OUTs数量减少19.26 %，中根型(B)处理减少14.79 %。

2.2.2 OUT统计的图形化展示 Venn 图可直观地表现出不同处理间 OTU的重叠情况[11]，而不同 OTU 代表不同物种，所以共有的OTU越多表示共有的细菌类群越多。从图1可以看出，不同处理之间共有的细菌 OTU 数目为459 个。深根型(A)与中根型(B)共有OTU 数目最多623个，其次深根型(A)与浅根型(C)OTU 数目614个，中根型(B)与浅根型(C)OTU 数目522个。说明深根型(A)与中根型(B)共有的细菌类群最多(图1)。

图1 不同处理土壤细菌Venn图Fig.1 Venn diagrams of soil bacterial in the different treatments

2.3 土壤细菌群落多样性分析

2.3.1 Alpha 多样性分析 Alpha 多样性指数包括Observed Species、Shannon 指数、Chao 指数、Goods Coverage、Simpson 指数等。Good’s Coverage(Good’s nonparametic Coverage Estimator)指数用来反映测序深度，首先由 Warren[17]提出；Observed Species 由样品序列来表征观测物种的多样性指数；Chao指数用来估计群落中实际存在的物种数，其计算方法参见文献[13]； Shannon指数反映样品的多样性程度，其值越高表明群落物种的多样性越高；Simpson指数反映了物种的优势度。本研究在97 %相似度下，选取平均序列为25 010条的序列计算多样性指数(表3)。

表3 不同处理土壤细菌丰富度及多样性指数

表4 土壤细菌群落多样性指数与土壤理化因子的相关性分析

注：*：显著相关(P<0.05)；**：极显著相关(P<0.01)。

Note:*:Significant level at 0.05 level; **:Significant level at 0.01 level.

3个处理中Good’s Coverage指数大于0.930接近1，表明测序深度基本已经覆盖样品中所有的物种。并且深根型(A处理)Observed species显著高于其他2个处理12.31 %，18.52 %。深根型(A处理)Chao 指数显著高于浅根型(C处理)13.86 %，与中根型(B)差异不显著。深根型(C处理)Shannon指数显著高于中根型(B)，与浅根型(C处理)差异不显著。3个处理间的Simpson 指数差异不明显。Observed species指数、Chao 指数、Shannon指数、Simpson 指数总体上呈现深根型(A处理)高于其他2个处理，说明深根型处理土壤细菌种群丰富度、土壤细菌优势度高于其他2种处理。

2.3.2 细菌多样性与土壤理化因子的相关性分析 由表4可知，Shannon 指数、Simpson 指数与pH值呈显著负相关关系，与有机碳呈显著正相关关系，与有机质、速效氮、速效钾呈正相关关系，与速效磷呈负相关关系。Chao 指数与有机碳、pH值呈显著负相关关系，与有机质、速效氮呈负相关关系，于速效磷、速效钾呈正相关关系。总体来看，土壤细菌多样指数与有机碳、pH值相关性较高，与速效钾呈正相关关系。

2.4 样品群落组成分析

2.4.1 细菌门分类水平的比较 在门分类水平上，3种不同根型苎麻根际土壤细菌分布在23个已知细菌门，1个未分类群体。由图2可知，在3个处理中含量最高的门是拟杆菌门(Bacteroidetes)，其深根型(A)、中根型(B)、浅根型(C)相对丰度依次为(平均数47.39)48.59 %、47.24 %、46.34 %；其次是厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度依次为(平均数36.57)36.18 %、36.84 %、 36.68 %；变形菌门(Proteobacteria)相对丰度依次为(平均数11.45)10.80 %、11.24 %、12.31 %；而其他菌类比例相对较低，例如放线菌门Actinobacteria，梭杆菌门Fusobacteria，绿菌门Chlorobi等。表明在3 种不同根型苎麻根际土壤细菌中，拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门为三大优势菌群(相对丰度>10 %)，三者丰度之和达到95 %以上，而其他细菌类群为非优势菌群。

图2 细菌群落门组成Fig.2 Composition of soil bacteria at phylum level

2.4.2 细菌纲分类水平的比较 在纲的分类水平上,共得到40 个已知的细菌纲。如图3所示，拟杆菌纲(Bacteroidia)，梭菌纲(Clostridia)，芽孢杆菌纲(Bacilli)，γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)，α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)，ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)，B-变形菌纲(Betaproteobacteria)，放线菌纲(Actinobacteria)类群等在细菌纲中相对丰度较大，相对丰度之和在 3 个处理土壤样品中均占到土壤细菌总量的 80 %以上。相对丰度>10 %的优势纲为拟杆菌纲(Bacteroidia)，梭菌纲 (Clostridia)，芽孢杆菌纲(Bacilli)；除极少数相对丰度极低的细菌纲,如热原体纲(Thermoplasmata)、硝化螺旋菌纲(Nitrospira)、迷踪菌纲(Elusimicrobia)等在3个处理 中的分布有所差异,其余已知丰度高的优势细菌纲在 3 个不同根型处理中均有分布。

图3 细菌群落纲组成Fig.3 Composition of soil bacteria at class level

图4 细菌群落属组成Fig.4 Composition of soil bacteria at genus level

2.4.3 细菌属分类水平的比较 在属分类水平上共得到289种细菌类群，优势属(相对丰度>1 %)有18个，如图4所示，其中含量最高的是Other，在3个处理中相对丰度分别为21.19 %，24.86 %，22.13 %；其次是不可培养细菌(uncultured bacterium)，不可培养的拟杆菌属(unculturedBacteroidalesbacterium)，乳酸杆菌属(Lactobacillus)，含糊不清的分类群(Ambiguous taxa)，毛螺菌科NK4A136组(Lachnospiraceae NK4A136 group)，普雷沃氏菌属9组(Prevotella 9)，不可培养菌属(uncultured)，拟杆菌属等(Bacteroides)，拟普雷沃菌属(Alloprevotella)，葡萄球菌属(Staphylococcus)。

3 讨 论

本研究利用 Illumina MiSeq 测序技术通过对16S rRNA 基因的 V3～V4 高变区的测序分析，成功检测了不同根型苎麻根际土壤细菌群落结构的多样性，获得了较全面的菌群信息。得到有效序列的总数为278 279，257 100条读数(reads)，30 664个OTUs。测序读长在 139～543 bp 之间，平均测序长度在420 bp左右。深根型(A)处理土壤含有最多数量的OTUs,其次是中根型(B)处理, 浅根型(C)处理OTUs数量最少。与深根型(A)相比,浅根型(C)处理土壤OTUs数量减少17.70 %,中根型(B)处理减少10.85 %。

Venn 图表明不同处理之间共有的细菌 OTU 数目为459 个。深根型(A)与中根型(B)共有OTU 数目最多623个，其次深根型(A)与浅根型(C)OTU 数目614个，中根型(B)与浅根型(C)OTU 数目522个。说明深根型(A)与中根型(B)共有的细菌类群最多。

王伏伟、杨娟等[18-19]的研究表明土壤理化性质对土壤细菌群落组成有显著的影响。本文Shannon 指数、Simpson 指数与PH值呈显著负相关关系，与有机碳呈显著正相关关系，与有机质、速效氮、速效钾呈正相关关系，与速效磷呈负相关关系。Chao 指数与有机碳、pH值呈显著负相关关系，与有机质、速效氮呈负相关关系，于速效磷、速效钾呈正相关关系。总体来看，土壤细菌多样指数与有机碳、pH值相关性较高，与速效钾呈正相关关系。

样品群落组成分析表明每个处理的土壤根际细菌优势门(相对丰度>10 %)、优势纲(相对丰度>10 %)、优势属(相对丰度>1 %)基本相同。土壤细菌优势门(相对丰度>10 %)拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和 变形菌门(Proteobacteria)；优势纲(相对丰度>10 %)拟杆菌纲(Bacteroidia)，梭菌纲 (Clostridia)，芽孢杆菌纲(Bacilli)；优势属(相对丰度>1 %)有18个。

本研究还发现苎麻根际土壤细菌中还有很多未分类物种，但其功能和特点尚不清楚，有待更深入的研究探索。

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